İlkel Germ Hücresi Kriyoprezervasyonu ve Drosophila Suşlarının Canlanması
Summary
Yetişkin sineklerin sık sık taze gıda şişelerine aktarılmasına alternatif olarak Drosophila suşları için uzun süreli bir koruma yöntemi oldukça arzu edilir. Bu protokol, Drosophila primordial germ hücrelerinin dondurularak saklanmasını ve agametik konakçı embriyolara nakledilmeleri yoluyla suşun yeniden canlandırılmasını açıklar.
Abstract
Drosophila suşları, yetişkin sineklerin sık sık yeni şişelere aktarılmasıyla korunmalıdır. Bu, mutasyonel bozulma ve fenotipik değişiklikler tehlikesi taşır. Bu nedenle, bu tür değişiklikler olmadan uzun süreli koruma için alternatif bir yöntemin geliştirilmesi zorunludur. Önceki başarılı girişimlere rağmen, Drosophila embriyolarının dondurularak saklanması, düşük tekrarlanabilirlik nedeniyle hala pratik kullanımda değildir. Burada, kriyo ile korunmuş PGC’lerin agametik Drosophila melanogaster (D. melanogaster) konakçı embriyolarına nakli yoluyla primordial germ hücresi (PGC) kriyoprezervasyonu ve suş canlanması için bir protokol tanımlanmıştır. PGC’ler kriyoprotektif ajanlara (CPA’lar) karşı oldukça geçirgendir ve suşlar arasındaki gelişimsel ve morfolojik varyasyon, embriyo kriyoprezervasyonundan daha az sorunludur. Bu yöntemde, yaklaşık 30 donör embriyodan PGC’ler toplanır, CPA tedavisinden sonra bir iğneye yüklenir ve daha sonra sıvı nitrojen içinde dondurularak saklanır. Donör kaynaklı gametler üretmek için, bir iğnedeki dondurularak saklanmış PGC’ler çözülür ve daha sonra yaklaşık 15 agametik konakçı embriyoya bırakılır. Bu protokol ile en az %15 verimli sinek sıklığı elde edildi ve verimli çift başına düşen döl sayısı her zaman orijinal suşu canlandırmak için fazlasıyla yeterliydi (ortalama döl sayısı 77.2 ± 7.1’dir), bu da dondurularak saklanmış PGC’lerin germ hattı kök hücrelerine dönüşme yeteneğini gösterir. İğne başına ortalama verimli sinek sayısı 1.1 ± 0.2 idi ve 26 iğneden 9’u iki veya daha fazla verimli döl üretti. 11 iğnenin, en az bir dişi ve bir erkeğin dahil olduğu 6 veya daha fazla döl üretmek için yeterli olduğu bulundu. Agametik konakçı, yeni ortaya çıkan dişi ve erkek sinekleri çaprazlayarak suşu hızlı bir şekilde canlandırmayı mümkün kılar. Ek olarak, PGC’ler, genom düzenleme gibi genetik mühendisliği uygulamalarında kullanılma potansiyeline sahiptir.
Introduction
Yetişkin sineklerin yeni gıda şişelerine aktarılmasıyla Drosophila suşlarının bakımı, kaçınılmaz olarak zaman içinde mutasyonların ve epigenetik değişikliklerin birikmesine neden olur. Drosophila suşlarının bu tür değişiklikler olmadan uzun süreli bakımı için alternatif bir yöntemin geliştirilmesi, özellikle tüm genomun korunması gereken referans suşlar için zorunludur. Drosophila embriyolarını veya yumurtalıklarını kriyoprezervasyona yönelik birkaç başarılı girişim tanımlanmıştır 1,2,3. Ne yazık ki, düşük tekrarlanabilirlik nedeniyle hala pratik kullanımda değiller. Gerçekten de, erken evre embriyolar, kriyoprotektif ajan (CPA) geçirgenliğini ve difüzyonunu engelleyen yüksek yumurta sarısı içeriği nedeniyle kriyoprezervasyondan sonra düşük bir hayatta kalma oranına sahiptir 2,3. CPA geçirgenliği, geç evre embriyoların mumsu katmanları tarafından da ciddi şekilde sınırlandırılmıştır. Embriyoların yüksek bir hayatta kalma oranına ve daha ince bir balmumu tabakasına sahip olduğu, suşa özgü bir zaman periyodu bulmak zor ve zaman alıcıdır. Son zamanlarda, Zhan ve ark.4 embriyo geçirgenliği, CPA yüklemesi ve vitrifikasyon yöntemlerini geliştirdi ve çoklu suşların embriyolarını başarıyla dondurarak sakladı. Bununla birlikte, yöntemlerin uygulanması kolay değildir, çünkü geçirgenlikten sonra embriyoların canlılığı zayıf olma eğilimindedir. Bu nedenle, alternatif yaklaşımların daha da iyileştirilmesine ve geliştirilmesine hala ihtiyaç vardır. İlkel germ hücrelerinin (PGC’ler) dondurularak saklanmasını içeren yöntemler, Drosophila suşlarının uzun süreli bakımı için alternatif bir yaklaşımdır.
PGC (kutup hücresi olarak da adlandırılır) transplantasyonu, zigotik ölümcül mutasyonların maternal etkileri ve germ hücrelerinin cinsiyet tayini gibi süreçleri incelemek için germ hattı kimeraları, özellikle dişiler üretmek için kullanılmıştır 5,6,7,8,9,10,11,12 . PGC’ler embriyolardan çok daha küçüktür ve çoğu kriyoprotektan için oldukça geçirgen olmaları muhtemeldir. Ayrıca, suşlar arasındaki gelişimsel ve morfolojik varyasyon daha az sorunludur ve agametik bir konakçı, tüm genomların hızlı bir şekilde restorasyonunu sağlar. Yakın zamanda, Drosophila suşlarında kaçınılmaz olan genetik ve epigenetik değişiklikleri önleyen yeni bir PGC kriyoprezervasyon13 yöntemi geliştirdik. Burada ayrıntılı protokolü sunuyoruz.
Bu kriyoprezervasyon yöntemi, PGC işleme ve enstrümantasyonunda özel uzmanlık gerektirir. Adım adım yaklaşım, aşina olmayanlar için etkili bir çözüm olsa da, enstrümantasyon gereksinimleri nedeniyle küçük laboratuvarlar için uygun olmayabilir. Bu PGC kriyoprezervasyon protokolü, daha küçük gelişimsel ve morfolojik farklılıklar nedeniyle embriyo kriyoprezervasyon protokollerinden farklı Drosophila türleri ve farklı böcek türleri ile kullanım için daha kolay uyarlanabilir. PGC’ler, genom düzenleme 14,15,16 gibi genetik mühendisliği uygulamalarında da potansiyel olarak kullanılabilir. Özetle, bu yöntem, stok merkezlerinde ve diğer laboratuvarlarda, sinek ve diğer böcek türlerini değişiklik yapmadan uzun süre korumak için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
PGC kriyoprezervasyonu ve canlandırmasında başarı için kritik bir faktör iyi embriyoların kullanılmasıdır. Embriyo toplama için genç dişiler (örneğin, 3 ila 5 günlük) kullanılmalıdır. Hem donör hem de konakçı embriyolar mikroskobik inceleme ile değerlendirilir ve sadece blastoderm aşamasındakiler (evre 5) kullanılır12. PGC toplama için, genellikle 20 dakikalık bir süre içinde yaklaşık 40 donör embriyoyu hizalarız ve erken evre 5’te yaklaşık 30 embriyodan PGC t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Sinek suşları için KYOTO Drosophila Stok Merkezi’ne teşekkür ederiz. Ayrıca, makalenin İngilizce düzenlemesi için Bayan Wanda Miyata’ya ve bu makalenin taslağını düzenlediği için Edanz’dan (https://jp.edanz.com/ac) Dr. Jeremy Allen’a teşekkür ederiz. Bu çalışma, Japonya Tıbbi Araştırma ve Geliştirme Ajansı’ndan (AMED) T.T.-S.-K.’ye hibeler (JP16km0210072, JP17km0210146, JP18km0210146), AMED’den S.K.’ye hibeler (JP16km0210073, JP17km0210147, JP18km0210145), AMED’den T.T.-S.-K.’ye hibeler (JP20km0210172) ile desteklenmiştir. ve S.K., Japonya Bilimi Teşvik Derneği’nden (JSPS) T.T.-S.-K.’ye Bilimsel Araştırma Hibesi (C) (JP19K06780) ve JSPS’den SK’ye Yenilikçi Alanlarda Bilimsel Araştırma için Yardım Hibesi (JP18H05552)
Materials
| Acetic acid | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 017-00256 | For embryo collection |
| Agar powder | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 010-08725 | For embryo collection |
| Calcium chloride | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 038-24985 | For EBR solution |
| Capillary | Sutter Instrument | B100-75-10-PT | BOROSILICATE GLASS; O.D: 1.0mm, I.D: 0.75mm , length: 10cm, 225Pcs |
| Capillary holder | Eppendorf | 5196 081.005 | Capillary holder 4; for micromanipulation |
| Chromic acid mixture | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 037-05415 | For needle washing |
| CPA solution | 1x EBR containing 20% ethylene glycol and 1M sucrose | ||
| Double-sided tape | 3M | Scotch w-12 | For glue extracting |
| Ephrussi–Beadle Ringer solution (EBR) | 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, and 10 mM Hepes at pH 6.9 | ||
| Ethanol (99.5) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 057-00451 | For embryo collection |
| Ethylene glycol | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 054-00983 | For CPA solution |
| Falcon 50 mm x 9 mm bacteriological petri dish | Corning Inc. | 351006 | For embryo collection |
| Forceps | Vigor | Type5 Titan | For embryo handling |
| Grape juice | Asahi Soft Drinks Co., LTD. | Welch's Grape 100 | For embryo collection |
| Grape juice agar plate | 50% grape juice, 2% agar, 1% ethanol, 1% acetic acid | ||
| Heptane | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 084-08105 | For glue extracting |
| Humidifier | APIX INTERNATIONAL CO., LTD. | FSWD2201-WH | For embryo preparation |
| Inverted microscope | Leica Microsystems GmbH | Leica DM IL LED | For micromanipulation |
| Luer-lock glass syringe | Tokyo Garasu Kikai Co., Ltd. | 0550 14 71 08 | Coat a plunger with silicon oil (FL-100-450CS);for micromanipulation |
| Mechanical micromanipulator | Leica Microsystems GmbH | For micromanipulation | |
| Micro slide glass | Matsunami Glass Ind., Ltd. | S-2441 | For embryo aligning |
| Microgrinder | NARISHIGE Group | Custom order | EG-401-S combined EG-401 and MF2 (with ocular lens MF2-LE15 ); for needle preparation |
| Microscope camera | Leica Microsystems GmbH | Leica MC170 HD | For micromanipulation |
| Needle holder | Merck KGaA | Eppendorf TransferTip (ES) | For cryopreservation |
| Potassium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 28514-75 | For EBR solution |
| Puller | NARISHIGE Group | PN-31 | For needle preparation; the heater level is set to 85.0-98.4, the magnet main level to 57.8, and the magnet sub level to 45.0. |
| PVC adhesive tape for electric insulation | Nitto Denko Corporation | J2515 | For embryo-pool frame |
| Silicon oil | Shin-Etsu Chemical, Co, Ltd. | FL-100-450CS | For embryo handling |
| Sodium chloride | Nacalai Tesque, Inc. | 31320-05 | For EBR solution |
| Sodium hypochlorite solution | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 197-02206 | Undiluted and freshly prepared; for embryo breaching |
| Sucrose | Nacalai Tesque, Inc. | 30404-45 | For CPA solution |
References
- Brüschweiler, W., Gehring, W. A method for freezing living ovaries of Drosophila melanogaster larvae and its application to the storage of mutant stocks. Experientia. 29, 134-135 (1973).
- Steponkus, P. L., et al. Cryopreservation of Drosophila melanogaster embryos. Nature. 345, 170-172 (1990).
- Mazur, P., Cole, K. W., Hall, J. W., Schreuders, P. D., Mahowald, A. P. Cryobiological preservation of Drosophila embryos. Science. 258 (5090), 1932-1935 (1992).
- Zhan, L., Li, M. G., Hays, T., Bischof, J. Cryopreservation method for Drosophila melanogaster embryos. Nat Comm. 12, 2412 (2021).
- Van Deusen, E. B. Sex determination in germ line chimeras of Drosophila melanogaster. Development. 37 (1), 173-185 (1977).
- Breen, T. R., Duncan, I. M. Maternal expression of genes that regulate the bithorax complex of Drosophila melanogaster. Dev Biol. 118, 442-456 (1986).
- Schupbach, T., Wieschaus, E. Germline autonomy of maternal-effect mutations altering the embryonic body pattern of Drosophila. Dev Biol. 113, 443-448 (1986).
- Irish, V., Lehmann, R., Akam, M. The Drosophila posterior-group gene nanos functions by repressing hunchback activity. Nature. 338, 646-648 (1989).
- Hülskamp, M., Schröder, C., Pfeifle, C., Jäckle, H., Tautz, D. Posterior segmentation of the Drosophila embryo in the absence of a maternal posterior organizer gene. Nature. 338, 629-632 (1989).
- Steinmann-Zwicky, M., Schmid, H., Nöthiger, R. Cell-autonomous and inductive signals can determine the sex of the germ line of Drosophila by regulating the gene Sxl. Cell. 57 (1), 157-166 (1989).
- Stein, D., Roth, S., Vogelsang, E., Nüsslein-Volhard, C. The polarity of the dorsoventral axis in the drosophila embryo is defined by an extracellular signal. Cell. 65 (5), 725-735 (1991).
- Kobayashi, S., Yamada, M., Asaoka, M., Kitamura, T. Essential role of the posterior morphogen nanos for germline development in Drosophila. Nature. 380, 708-711 (1996).
- Asaoka, M., et al. Offspring production from cryopreserved primordial germ cells in Drosophila. Comm Biol. 4 (1), 1159 (2021).
- Blitz, I. L., Fish, M. B., Cho, K. W. Y. Leapfrogging: primordial germ cell transplantation permits recovery of CRISPR/Cas9-induced mutations in essential genes. Development. 143 (15), 2868-2875 (2016).
- Koslová, A., et al. Precise CRISPR/Cas9 editing of the NHE1 gene renders chickens resistant to the J subgroup of avian leukosis virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2108-2112 (2020).
- Zhang, F. Efficient generation of zebrafish maternal-zygotic mutants through transplantation of ectopically induced and Cas9/gRNA targeted primordial germ cells. J Genet Genom. 47 (1), 37-47 (2020).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. Stages of Drosophila Embryogenesis. The Embryonic Development of Drosophila. , (1997).
- Manning, A. A sperm factor affecting the receptivity of Drosophila melanogaster females. Nature. 194, 252-253 (1962).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cell Mol Life Sci. 60, 1689-1704 (2003).
- Lehmann, R., Nüsslein-Volhard, C. Abdominal segmentation, pole cell formation, and embryonic polarity require the localized activity of oskar, a maternal gene in drosophila. Cell. 47 (1), 141-152 (1986).
- Kiger, A. A., Gigliotti, S., Fuller, M. T. Developmental genetics of the essential Drosophila Nucleoporin nup154: allelic differences due to an outward-directed promoter in the P-element 3′ end. Génétique. 153 (2), 799-812 (1999).
- Rienzi, L. F., et al. Perspectives in gamete and embryo cryopreservation. Semin Reprod Med. 36 (5), 253-264 (2018).
