Summary

Metabolomica arterovenosa per misurare lo scambio di metaboliti in vivo nel tessuto adiposo bruno

Published: October 06, 2023
doi:

Summary

In questo protocollo, vengono descritti i metodi rilevanti per la metabolomica arterovenosa ottimizzata per BAT utilizzando GC-MS in un modello murino. Questi metodi consentono l’acquisizione di preziose informazioni sullo scambio di metaboliti mediati da BAT a livello di organismo.

Abstract

Il tessuto adiposo bruno (BAT) svolge un ruolo cruciale nella regolazione dell’omeostasi metabolica attraverso un processo di dispendio energetico unico noto come termogenesi senza brividi. Per raggiungere questo obiettivo, BAT utilizza un menu diversificato di nutrienti circolanti per supportare la sua elevata domanda metabolica. Inoltre, BAT secerne fattori bioattivi derivati da metaboliti che possono fungere da combustibili metabolici o molecole di segnalazione, facilitando la comunicazione intratissutale e/o intertissutale mediata da BAT. Ciò suggerisce che BAT partecipi attivamente allo scambio sistemico di metaboliti, una caratteristica interessante che sta iniziando ad essere esplorata. Qui, introduciamo un protocollo per la metabolomica arterovenosa BAT ottimizzata a livello di topo in vivo . Il protocollo si concentra su metodi rilevanti per le stimolazioni termogeniche e su una tecnica di prelievo di sangue arterovenoso utilizzando la vena di Sulzer, che drena selettivamente il sangue venoso interscapolare derivato da BAT e il sangue arterioso sistemico. Successivamente, viene dimostrato un protocollo metabolomico basato sulla gascromatografia che utilizza quei campioni di sangue. L’uso di questa tecnica dovrebbe ampliare la comprensione dello scambio di metaboliti regolati dalle BAT a livello interorgano, misurando l’assorbimento netto e il rilascio di metaboliti da parte delle BAT.

Introduction

Il tessuto adiposo bruno (BAT) possiede una proprietà unica di dispendio energetico nota come termogenesi non tremante (NST), che coinvolge sia i meccanismi dipendenti dalla proteina di disaccoppiamento mitocondriale 1 (UCP1) che quelli indipendenti da UCP1 1,2,3,4,5. Queste caratteristiche distintive implicano BAT nella regolazione del metabolismo sistemico e nella patogenesi delle malattie metaboliche, tra cui l’obesità, il diabete di tipo 2, le malattie cardiovascolari e la cachessia tumorale 6,7,8. Recenti studi retrospettivi hanno mostrato un’associazione inversa tra la massa di BAT e/o la sua attività metabolica con l’obesità, l’iperglicemia e la salute cardiometabolica nell’uomo 9,10,11.

Recentemente, il BAT è stato proposto come un pozzo metabolico responsabile del mantenimento della NST, in quanto richiede notevoli quantità di nutrienti circolanti come combustibile termogenico 6,7. Inoltre, BAT può generare e rilasciare fattori bioattivi, denominati adipochine brune o BATokines, che agiscono come segnali endocrini e/o paracrini, indicando il suo coinvolgimento attivo nell’omeostasi metabolica a livello di sistema 12,13,14,15. Pertanto, la comprensione del metabolismo dei nutrienti del BAT dovrebbe migliorare la nostra comprensione del suo significato fisiopatologico negli esseri umani, al di là del suo ruolo convenzionale come organo termoregolatore.

Gli studi metabolomici che impiegano traccianti isotopici stabili, in combinazione con i classici studi sull’assorbimento dei nutrienti utilizzando radiotraccianti non metabolizzabili, hanno migliorato significativamente la nostra comprensione di quali nutrienti sono assorbiti preferenzialmente da BAT e di come vengono utilizzati 16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27. Ad esempio, studi sui traccianti radioattivi hanno dimostrato che il BAT attivato a freddo assorbe glucosio, acidi grassi legati alle lipoproteine e aminoacidi a catena ramificata 16,17,18,19,20,21,22,23,27. Recenti tracciamenti isotopici combinati con studi metabolomici ci hanno permesso di misurare il destino metabolico e il flusso di questi nutrienti all’interno dei tessuti e delle cellule in coltura 24,25,26,28,29,30. Tuttavia, queste analisi si concentrano principalmente sull’utilizzo individuale dei nutrienti, lasciandoci con una conoscenza limitata dei ruoli a livello di sistema di BAT nello scambio di metaboliti d’organo. Le domande riguardanti la serie specifica di nutrienti circolanti consumati dalle BAT e i loro contributi quantitativi in termini di carbonio e azoto rimangono elusive. Inoltre, l’esplorazione della possibilità che BAT possa generare e rilasciare BATokine derivate da metaboliti (ad esempio, lipocine) utilizzando sostanze nutritive è solo all’inizio 12,13,14,15,31,32.

L’analisi del sangue arterovenoso è un approccio fisiologico classico utilizzato per valutare l’assorbimento o il rilascio specifico di molecole circolanti in organi/tessuti. Questa tecnica è stata precedentemente applicata al BAT interscapolare dei ratti per misurare l’ossigeno e diversi metaboliti, stabilendo così il BAT come il principale sito di termogenesi adattativa con il suo potenziale catabolico 33,34,35,36,37. Recentemente, uno studio arterovenoso che utilizza BAT interscapolare di ratto è stato accoppiato con un approccio trans-omico, che ha portato all’identificazione di BATokines non ancora scoperte rilasciate da BAT38 stimolate termogenicamente.

I recenti progressi nella metabolomica basata sulla gascromatografia e sulla cromatografia liquida ad alta sensibilità (GC-MS e LC-MS) hanno riacceso l’interesse per gli studi arterovenosi per l’analisi quantitativa dello scambio di metaboliti organo-specifici 39,40,41. Queste tecniche, con il loro elevato potere risolutivo e l’accuratezza della massa, consentono l’analisi completa di un’ampia gamma di metaboliti utilizzando piccole quantità di campione.

In linea con questi progressi, un recente studio ha adattato con successo la metabolomica arterovenosa per lo studio di BAT a livello di topo, consentendo l’analisi quantitativa delle attività di scambio di metaboliti in BAT in diverse condizioni42. Questo articolo presenta un protocollo di metabolomica arterovenosa mirata a BAT che utilizza GC-MS in un modello murino C57BL/6J.

Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati condotti con l’approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali dell’Università di Sungkyunkwan (IACUC). I topi sono stati alloggiati in una struttura per animali approvata dalla IACUC situata in una camera bianca impostata a 22 °C e 45% di umidità, seguendo un ciclo giornaliero di luce/buio di 12 ore. Erano tenuti in rastrelliere ventilate e avevano accesso a una dieta standard ad libitum (comprendente il 60% di carboidrati, il 16% di proteine e il 3% di grass…

Representative Results

La Figura 1 illustra lo schema sperimentale della metabolomica AV ottimizzata per BAT. Come accennato nella sezione Protocollo, per ottenere tessuti adiposi bruni stimolati in modo differenziale, i topi vengono sottoposti ad acclimatazione termica utilizzando incubatrici per roditori o ricevono somministrazione farmacologica come agonisti del recettore β-adrenergico. Successivamente, i topi vengono anestetizzati e vengono raccolti campioni di sangue per l’analisi metabolomica (<strong class…

Discussion

Un passo fondamentale per comprendere il potenziale metabolico del BAT nell’equilibrio energetico di tutto il corpo è definire quali nutrienti consuma, come vengono metabolicamente elaborati e quali metaboliti vengono rilasciati nella circolazione. Questo protocollo introduce una tecnica specializzata di campionamento arterovenoso che consente l’accesso alla vascolarizzazione venosa del BAT interscapolare e alla vascolarizzazione arteriosa sistemica nei topi C57BL/6J, che è stata recentemente sviluppata e convalidata d…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo tutti i membri dei laboratori Choi e Jung per la discussione metodologica. Ringraziamo C. Jang e D. Guertin per i consigli e i feedback. Si ringrazia M.S. Choi per la lettura critica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato da NRF-2022R1C1C1012034 a S.M.J.; NRF-2022R1C1C1007023 a D.W.C; NRF-2022R1A4A3024551 a S.M.J. e D.W.C. Questo lavoro è stato supportato dalla Chungnam National University per W.T.K. La Figura 1 e la Figura 2 sono state create utilizzando BioRender (http://biorender.com/).

Materials

0.5-20 µL Filter Tips Axygen AX.TF-20-R-S
1 mL Syringe with attached needle – 26 G 5/8" BD Biosciences 309597
Agilent 5977B GC/MSD (mass selective detector) Agilent G7077B
Agilent 7693A Autosampler Agilent G4513A
Agilent 8890 GC System Agilent G3542A
Agilent J&W GC column (Capilary column) HP-5MS UI Agilent 19091S-433UI
Agilent MassHunter Workstation software_MS Quantitative analysis(Quant-My-way) Agilent G3335-90240
C57BL/6J mouse DBL C57BL/6JBomTac
CentriVap -50 °C Cold Trap (with Stainless steel Lid) LABCONCO  7811041
DL-Norvaline Sigma-Aldrich N7502-25G
Eppendorf centrifuge 5430R Eppendorf 5428000210
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL Eppendorf 30120086
Glass insert 250 μL  Agilent 5181-1270
Methanol (LC-MS grade) Sigma-Aldrich Q34966-1L
Methoxyamine hydrochloride Sigma-Aldrich 226904-5G
Microvette 200 Serum, 200 µL, cap red, flat base Sarstedt 20.1290.100
MTBSTFA Sigma-Aldrich 394882-100ML
Pyridine(anhydrous, 99.8%) Sigma-Aldrich 270970-100ML
Refrigerated CentriVap Complete Vaccum Concentrators LABCONCO  7310041
Rodent diet SAFE SAFE R+40-10
Rodent incubator Power scientific RIT33SD
Ultra-Fine Pen Needles – 29 G 1/2" BD Biosciences 328203
Vial Cap 9 mm Agilent 5190-9067
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL Agilent 5190-9063
Vial, ambr scrw wrtn 2 mL+A2:C40 Axygen PCR-02-C

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Citer Cet Article
Lee, S., Lim, G., Kim, S., Kim, H., Roh, Y. J., Kim, W., Choi, D. W., Jung, S. M. Arteriovenous Metabolomics to Measure In Vivo Metabolite Exchange in Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (200), e66012, doi:10.3791/66012 (2023).

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