Whole Mount Imaging을 통해 Peripheral Lens 구조, 세포 형태 및 조직을 시각화하고 정량화할 수 있습니다.
Summary
본 프로토콜은 이미지 정량화 방법을 사용하여 접안 렌즈의 주변 구조를 시각화하기 위한 새로운 전체 마운트 이미징을 설명합니다. 이러한 프로토콜은 렌즈 마이크로스케일 구조와 렌즈 발달/기능 간의 관계를 더 잘 이해하기 위한 연구에 사용할 수 있습니다.
Abstract
수정체는 다양한 거리의 빛을 망막에 집중시키기 위해 모양을 바꾸는 투명하고 유연한 조직입니다. 캡슐이라고 하는 장기를 둘러싼 기저막을 제외하고, 수정체는 전반구에 있는 상피 세포의 단층과 수정체 섬유 세포의 벌크 덩어리로 구성된 완전한 세포입니다. 일생 동안 상피 세포는 수정체 적도의 발아 영역에서 증식하고 적도 상피 세포는 새로 형성된 섬유 세포로 이동, 연장 및 분화합니다. 적도 상피 세포는 무작위로 채워진 조약돌 모양의 세포에서 자오선을 형성하는 정렬된 육각형 모양의 세포로 형태를 실질적으로 변경합니다. 새로 형성된 수정체 섬유 세포는 육각형 세포 모양을 유지하고 전극과 후극을 향해 길쭉하게 뻗어 이전 세대의 섬유 위에 겹쳐진 새로운 세포 껍질을 형성합니다. 수정체 상피 세포의 놀라운 형태 형성을 섬유 세포로 유도하는 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없습니다. 렌즈의 구조, 발달 및 기능을 더 잘 이해하기 위해 접안렌즈의 전체 마운트를 사용하여 주변 구조를 이미지화하는 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 여기서는 캡슐 두께, 상피 세포 면적, 세포 핵 면적 및 모양, 자오선 행 세포 순서 및 패킹, 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이러한 측정은 평생 수정체가 성장하는 동안 발생하는 세포 변화를 설명하고 나이 또는 병리학에 따라 발생하는 변화를 이해하는 데 필수적입니다.
Introduction
수정체는 눈의 앞쪽에 위치한 유연하고 투명한 조직으로, 망막에 빛을 미세하게 초점을 맞추는 기능을 합니다. 렌즈의 기능 능력은 부분적으로는 렌즈의 복잡한 구조와 조직 1,2,3,4,5,6에 기인합니다. 수정체 조직을 둘러싸고 있는 캡슐은 수정체 구조와 생체역학적 특성을 유지하는 데 필수적인 기저막입니다 7,8,9. 수정체 자체는 완전히 세포형이며 상피 세포와 섬유 세포의 두 가지 세포 유형으로 구성됩니다. 상피층은 렌즈(10)의 전반구를 덮는 직육면체 세포의 단층으로 구성된다. 일생 동안 상피 세포는 증식하여 수정체 캡슐을 따라 수정체 적도를 향해 이동합니다. 전방 상피 세포는 단면이 정지되어 있고 조약돌이며, 수정체 적도 근처에서 상피 세포가 증식하여 새로운 섬유 세포로 분화 과정을 거치기 시작합니다11,12. 적도 상피 세포는 무작위로 포장된 세포에서 육각형 모양의 세포가 있는 조직화된 분열 열로 변형됩니다. 육각형 세포 모양은 이러한 분화 세포의 기저 쪽에서 유지되는 반면 정점 쪽은 수정체 받침점 또는 수정체 4,13,14,15에서 수축 및 고정됩니다. 적도 상피 세포가 새로 형성된 섬유 세포로 늘어나기 시작하면 세포의 정점 끝은 전방 상피 세포의 정점 표면을 따라 전극을 향해 이동하는 반면 기저 끝은 수정체 캡슐을 따라 후방 극을 향해 이동합니다. 새로운 세대의 섬유 셀은 이전 세대의 셀을 오버레이하여 섬유의 구형 껍질을 만듭니다. 세포 신장 및 성숙 과정 동안, 섬유 세포는 실질적으로 그들의 형태를 변화시킨다 11,12,16. 이 섬유 세포는 렌즈 질량 11,12,16,17,18의 대부분을 형성합니다.
복잡한 수정체 미세 구조, 세포 형태 및 독특한 세포 조직을 확립하는 데 기여하는 분자 메커니즘은 완전히 알려져 있지 않습니다. 또한, 수정체 캡슐과 세포 구조가 전체 수정체 기능(투명도, 수정체 형태 변화)에 기여하는 정도는 불분명합니다. 그러나 이러한 관계는 새로운 이미징 방법론과 수정체의 구조적 및 세포 특징에 대한 정량적 평가를 사용하여 해명되고 있습니다 2,4,19,20,21,22. 렌즈 캡슐, 상피 세포 및 말초 섬유 세포의 높은 공간 해상도 시각화를 가능하게 하는 전체 렌즈를 이미지화하는 새로운 프로토콜이 개발되었습니다. 여기에는 캡슐 두께, 세포 크기, 세포핵 크기 및 원형도, 자오선 행 순서, 섬유 세포 패킹 및 섬유 세포 너비를 정량화하는 방법론이 포함됩니다. 이러한 시각화 및 이미지 정량화 방법은 심층적인 형태 측정 검사를 가능하게 하며 전체 3D 조직 구조를 보존함으로써 다른 시각화 방법(평면 마운트 또는 조직 절편의 이미징)에 비해 장점이 있습니다. 이러한 방법은 새로운 가설을 검증할 수 있게 해주었으며, 수정체 세포 패턴의 발달과 기능에 대한 이해를 지속적으로 발전시킬 것입니다.
다음 실험에서는 남녀 모두 6주에서 10주 사이의 C57BL/6J 배경에서 야생형 및 Rosa26-tdTomato 마우스 탠덤 이량체-Tomato(B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories))를 사용합니다. tdTomato 마우스는 N-말단 미리스타일화 및 내부 시스테인-팔미토일화 부위를 통해 원형질막을 표적으로 하는 돌연변이된 MARCKS 단백질의 N-말단 8 아미노산에 융합된 tdTomato 단백질의 발현을 통해 살아있는 수정체에서 세포 원형질막을 시각화할 수 있습니다23. 또한 로버트 아델스타인 박사(National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD)로부터 얻은 NMIIAE1841K/E1841K 마우스(24 )를 사용합니다. 앞서 기술한 바와 같이,20, CP49 비드 중간 필라멘트 단백질의 손실(성숙한 섬유 세포 형태 및 전체 수정체 생체역학 유지)이 있는 FvBN/129SvEv/C57Bl6 배경의 NMIIAE1841K/E1841K 마우스는 C57BL6/J 야생형 마우스와 역교배됩니다. 우리는 야생형 CP49 대립유전자의 존재에 대해 자손을 스크리닝했습니다.
컨포칼 이미징은 20x(NA = 0.8, working distance = 0.55mm, 1x zoom), 40x(NA = 1.3 oil objective, working distance = 0.2mm, 1x zoom) 또는 63x(NA = 1.4 oil objective, working distance = 0.19mm, 1x zoom) 배율로 레이저 스캐닝 컨포칼 형광 현미경에서 수행되었습니다. 모든 이미지는 광학 단면 두께의 결정 요인인 핀홀 크기를 사용하여 1 Airy Unit까지 획득했습니다(결과 광학 두께는 그림 범례에 명시되어 있음). 이미지는 Zen Software에서 처리되었습니다. 이미지를 .tif 형식으로 내보낸 다음 FIJI ImageJ Software(imageJ.net)로 가져왔습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
설명된 프로토콜은 렌즈의 전방 및 적도 영역에서 주변 렌즈 구조와 세포의 높은 공간 해상도를 시각화할 수 있습니다. 본 연구에서는 전체 3D 렌즈 구조가 보존된 온전한(라이브 또는 고정) 렌즈를 사용하여 렌즈 주변 구조를 시각화하는 방법을 보여주었습니다. 또한 공개적으로 사용 가능한 FIJI ImageJ 소프트웨어를 사용한 형태 측정 정량 분석을 위한 간단한 방법이 제공되었습니다. 전체 마운트 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 National Eye Institute Grant R01 EY032056 CC와 R01 EY017724 VMF와 National Institute of General Medical Sciences의 보조금 번호 P20GM139760의 지원을 받았습니다. STI는 화학-생물학 인터페이스 박사 전 교육 프로그램의 일환으로 NIH-NIGMS T32-GM133395의 지원을 받았으며 델라웨어 대학교 대학원 학자 상을 수상했습니다.
Materials
| 3 mm Biopsy Punch | Acuderm Inc | NC9084780 | |
| Agarose | Apex BioResearch Products | 20-102GP | |
| Antimycotic/Antibiotic | Cytiva | SV30079.01 | |
| Bovine Serum Albumin (Fraction V) | Prometheus | 25-529 | |
| Delicate task wipes | Kimwipe | ||
| Glass bottomed dish (Fluorodish) | World Precision International | FD35-100 | |
| Hoescht 33342 | Biotium | 40046 | |
| Laser scanning confocal Microscope 880 | Zeiss | ||
| MatTek Imaging Dish | MatTek Life Sciences | P35G-1.5-14 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 100503-917 | |
| PBS | GenClone | 25-507B | |
| Phenol red-free medium 199 | Gibco | 11043023 | |
| Rhodamine-Phalloidin | Thermo Fisher | 00027 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich | 11332481001 | |
| WGA-640 | Biotium | CF 640R |
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