طريقة تجانس عالية السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي لإنتاج الحويصلات المشتقة من الإندوسوم على نطاق واسع
Summary
هنا ، نصف طريقة التجانس عالية السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي للإنتاج على نطاق واسع للحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم كنوع جديد من محاكاة الإكسوسوم (EMs) التي تشترك في نفس الأصل البيولوجي والبنية المماثلة والتشكل وتكوين البروتين للحويصلات الأصلية خارج الخلية (EVs).
Abstract
جذبت الحويصلات خارج الخلية (EVs) اهتماما كبيرا في البحوث الفسيولوجية والمرضية وتشخيص الأمراض وعلاجها. ومع ذلك ، كانت ترجمتهم السريرية محدودة بسبب عدم وجود مناهج تصنيع واسعة النطاق. لذلك ، يوفر هذا البروتوكول طريقة تجانس عالية السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي للإنتاج على نطاق واسع للحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم كنوع جديد من محاكاة الإكسوسوم (EMs) المشتقة من الإندوسومات ، والتي لها عائد أعلى بحوالي 100 مرة من طريقة الطرد المركزي الفائق التقليدية. في هذه الطريقة ، تم استيعاب الجسيمات النانوية المغناطيسية (MNPs) بواسطة الخلايا الأبوية عن طريق التداخل الخلوي وتراكمت لاحقا داخل إندوسوماتها. بعد ذلك ، تم جمع الإندوسومات المحملة ب MNPs وتنقيتها عن طريق المعالجة منخفضة التوتر والفصل المغناطيسي. تم استخدام خالط عالي السرعة لكسر الإندوسومات المحملة ب MNP إلى حويصلات نانوية أحادية التشتت. تتميز الحويصلات المشتقة من الإندوسوم الناتجة بنفس الأصل البيولوجي والبنية ، والتي تتميز بتحليل تتبع الجسيمات النانوية ، والمجهر الإلكتروني النافذ ، والنشاف الغربي. يتشابه مورفولوجيتها وتكوين البروتين مع المركبات الكهربائية الأصلية ، مما يشير إلى أن EMs قد تكون بمثابة بديل منخفض التكلفة وعالي العائد للمركبات الكهربائية الأصلية للترجمات السريرية.
Introduction
الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي حويصلات صغيرة تفرزها جميع الخلايا تقريبا بحجم يتراوح بين 30 و 150 نانومتر ، وتحتوي على مواد نشطة بيولوجيا وفيرة. اعتمادا على خلية المنشأ ، تظهر EVs عدم تجانس عالي ، وتمتلك مكونات متعددة خاصة بالخلايا الأم1. يتم إطلاق EVs في سوائل الجسم ونقلها إلى مواقع بعيدة حيث يتم تناولها بواسطة الخلايا المستهدفة للعمل2 ، والتي يمكن استخدامها لتقديم مجموعة واسعة من الجزيئات والأدوية النشطة بيولوجيا لإصلاح الأنسجة وتشخيص الورم وعلاجه والتعديل المناعي 3,4. ومع ذلك ، فإن الجسيمات النانوية البيولوجية الأخرى (مثل البروتينات الدهنية) والحويصلات النانوية (على سبيل المثال ، EVs المشتقة من مسارات غير إندوزومية) ذات خصائص فيزيائية حيوية مماثلة في سوائل الجسم تؤثر حتما على عزل EV وتنقيته. حتى الآن ، لا يزال الطرد المركزي الفائق هو المعيار الذهبي لعزل EV ، وقد تم تطوير طرق عزل أخرى ، بما في ذلك الطرد المركزي المتدرج لكثافة السكروز ، والترشيح الفائق ، وترسيب البولي إيثيلين جلايكول ، والكروماتوغرافيا ، وعزل حبة المغناطيسية المناعية، 5. يتمثل عنق الزجاجة الحالي الذي يحد من الترجمة السريرية وتسويق علاجات المركبات الكهربائية في النقص الحاد في تقنيات العزل التي تسمح بعزل قابل للتطوير والتكرار بدرجة كبيرة للمركبات الكهربائية6،7،8. تعاني تقنيات عزل المركبات الكهربائية التقليدية (على سبيل المثال ، الطرد المركزي الفائق وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم) من انخفاض العائد (1 × 107-1 × 108/1 × 10 6 خلايا) ، ودورة إنتاج طويلة (24-48 ساعة) ، وضعف قابلية استنساخ جودة المنتج ، وتتطلب معدات إنتاج باهظة الثمن وكثيفة الاستهلاك للطاقة لا يمكنها تلبية الطلب السريري الحالي على المركبات الكهربائية6.
جذبت محاكاة Exosome (EMs) ، وهي بدائل اصطناعية للمركبات الكهربائية الأصلية ، اهتماما كبيرا نظرا لهيكلها ووظيفتها وقابليتها للتوسع في الإنتاج. المصدر الرئيسي لل EMs هو من البثق المباشر للخلايا الأبوية الكاملة مع التقسيم المستمر9,10 ، مما يدل على وظائف بيولوجية قوية مثل EVsالأصلية 11,12. على سبيل المثال ، تمارس EMs المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة للحبل السري البشري (hUCMSCs) تأثيرات مماثلة لالتئام الجروح مثل EVs الأصلية وهي أكثر ثراء في تكوين البروتين13. على الرغم من أن EMs المشتقة من خلايا كاملة لها التعقيد البيولوجي للمركبات الكهربائية ، إلا أن عيبها الرئيسي هو عدم تجانس المنتجات لأنها ملوثة حتما بالعضيات الخلوية المختلفة وحطام الخلايا. كشف تحليل توطين البروتين كذلك أن EMs المشتقة من بثق الخلية الكاملة تحتوي على العديد من البروتينات غير الخاصة ب EVs من الميتوكوندريا والشبكة الإندوبلازمية13. علاوة على ذلك ، لا تزال معظم طرق تصنيع EMs تتطلب الطرد المركزي الفائق ، وهي عملية تستغرق وقتا طويلا وتستهلك الطاقة14. بالنظر إلى حقيقة أن الإكسوسومات مشتقة حصريا من الإندوسومات الخلوية ، افترضنا أن الحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم المهندسة بيولوجيا قد تلخص بشكل أفضل التماثل البيولوجي بين الإكسوسومات و EMs مقارنة ب EMs المشتقة من غشاء الخلية الراسخة التي تنتجها طريقة بثق الخليةالكاملة 14. ومع ذلك ، فإن تصنيع الحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم أمر صعب بسبب عدم وجود نهج قابلة للتطبيق.
تم إجراء الدراسات السريرية من خلال استخدام EVs كبديل للعلاج الخالي من الخلايا ونظام توصيل الأدوية النانوية لعلاج الأمراض المختلفة. على سبيل المثال ، تم استخدام EVs المشتقة من الخلايا الجذعية الوسيطة لنخاع العظم لعلاج الالتهاب الرئوي الحاد الناجم عن COVID-19 وحققت نتائج واعدة. في الآونة الأخيرة ، أظهرت المركبات الكهربائية المعدلة وراثيا التي تحمل بروتينات CD24 أيضا فوائد علاجية قوية لعلاج مرضى COVID-1915,16. ومع ذلك ، لا يزال من غير الممكن تلبية المتطلبات السريرية للعلاج ب EV بطرق العزل التقليدية بسبب انخفاض العائد والتكلفة. تشير هذه الدراسة إلى الإنتاج الواسع النطاق للحويصلات النانوية المشتقة من الإندوسوم عبر نهج التجانس عالي السرعة بمساعدة الفصل المغناطيسي. يستفيد من مسار التداخل الخلوي ل MNPs لعزل الإندوسومات المحملة ب MNP عن طريق الفصل المغناطيسي ، يليه التجانس عالي السرعة لصياغة الإندوسومات في حويصلات نانوية أحادية التشتت. نظرا لأن أنواع الإندوسومات التي تم جمعها بواسطة هذا البروتوكول متنوعة ، فلا تزال هناك حاجة إلى مزيد من البحث المتعمق لإنشاء ممارسات تصنيع جيدة (GMP) في الصناعة. يعد نهج تحضير EM الجديد هذا أكثر كفاءة من حيث الوقت (5 دقائق من التجانس عالي السرعة) للحصول على حويصلات نانوية متماثلة مع المركبات الكهربائية الأصلية. ينتج حويصلات أكثر أضعافا مضاعفة من نفس الكميات من الخلايا مقارنة بالطرد المركزي الفائق ، والذي يمكن تطبيقه بشكل عام على أنواع مختلفة من الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
كبديل للعلاج الخالي من الخلايا ونظام توصيل الأدوية النانوي ، لم تلبي المركبات الكهربائية بعد توقعاتها السريرية ، والعقبة الرئيسية هي عدم وجود طرق إنتاج وتنقية قابلة للتطوير والتكرار6. لذلك ، تم تطوير أنواع مختلفة من EMs كنظائر EV ذات تعقيد بيولوجي مماثل14. حتى الآن ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يقر المؤلفون باستخدام الأدوات في المرفق الأساسي للأجهزة المشتركة في معهد الطب الأساسي والسرطان (IBMC) ، الأكاديمية الصينية للعلوم. تم دعم هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ؛ 82172598) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية بمقاطعة تشجيانغ ، الصين (LZ22H310001) ، ومشروع تدريب المواهب الصحية 551 التابع للجنة الصحة بمقاطعة تشجيانغ ، الصين ، ومشروع أبحاث التنمية الزراعية والاجتماعية التابع لمكتب العلوم والتكنولوجيا في بلدية هانغتشو (2022ZDSJ0474) ومنحة Qiantang للبحوث متعددة التخصصات.
Materials
| Annexin antibody | ABclonal | A11235 | Western blotting |
| BCA assay kit | Beyotime | P0012 | Protein concentration assay |
| Calnexin | GeneTex | HL1598 | Western blotting |
| CD63 antibody | ABclonal | A19023 | Western blotting |
| Cell lysis buffer for Western and IP | Beyotime | P0013 | Western blotting |
| Centrifuge | Beckman | Allegra X-30R | Cell centrifuge |
| CO2 incubator | Thermo | Cell culture | |
| Confocal laser scanning fluorescence microscopy | NIKON | A1 HD25 | Photo the fluorescence picture |
| DMEM basic (1x) | GIBCO | C11995500BT | Cell culture |
| Dynamic light scattering (DLS) | Malvern | Zetasizer Nano ZS ZEN3600 | Diameter analysis |
| Electric glass homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | DY89-II | Low-speed homogenization |
| Exosome-depleted FBS | system Bioscience | EXO-FBS-50A-1 | Cell culture |
| High-speed homogenizer | SCIENTZ(Ningbo, China) | XHF-DY | High-speed homogenization |
| Magnetic grate | Tuohe Electromechanical Technology (Shanghai, China) | NA | Magnetic separation |
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma-Aldrich | PKH26GL-1KT | The kit contains PKH26 cell linker in ethanol and Diluent C |
| Polylysine-modified iron oxide nanoparticles (IONPs) | Zhongke Leiming Technology (Beijing, China) | Mag1100-10 | Cell culture |
| Potassium chloride | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Protease inhibitor cocktail | Beyotime | P1030 | Proteinase inhibitor |
| Sodium citrate | Aladdin | 7447-40-7 | Cell hypotonic treatment |
| Transmission electron microscopy (TEM) | JEOL | JEM-2100plus | Morphology image |
| Ultracentrifuge | Beckman | Optima XPN-100 | Exosome centrifuge |
| ZetaView nanoparticle tracking analyzers | Particle Metrix | PMX120 | Nanoparticle tracking analysis |
References
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977 (2020).
- Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
- Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
- Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
- Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
- Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
- Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
- Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
- Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
- Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161 (2022).
- Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
- Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312 (2022).
- Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242 (2021).
- Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12 (2022).
- Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997 (2022).
- Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
- Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
- Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
- Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053 (2016).
