Nous présentons ici le premier protocole d’infiltration sous vide localisée pour des études in vivo de la transformation génétique de plantes de grande taille. En utilisant cette méthodologie, nous avons réalisé pour la première fois la transformation transitoire du cacao par Agrobacterium in planta .
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Article de méthode
Agro-infiltration forcée sous vide pour la transformation in planta de plantes récalcitrantes : le cacao comme étude de cas
Dans cet article
Résumé
Résumé
La transformation transitoire in planta est une alternative rapide et rentable pour la transformation génétique végétale. La plupart des protocoles de transformation in planta reposent sur l’utilisation de la transformation médiée par Agrobacterium. Cependant, les protocoles actuellement utilisés sont standardisés pour les usines de petite taille en raison des contraintes physiques et économiques liées à la soumission des usines de grande taille à un traitement sous vide. Ce travail présente un protocole efficace pour l’agroinfiltration localisée sous vide adaptée aux plantes de grande taille. Pour évaluer l’efficacité de la méthode proposée, nous avons testé son utilisation chez les cacaoyers, une espèce végétale tropicale récalcitrante à la transformation génétique. Notre protocole a permis d’appliquer jusqu’à 0,07 MPa sous vide, avec répétitions, sur une partie aérienne localisée des feuilles de cacaoyer, permettant de forcer l’infiltration d’Agrobacterium dans les espaces intercellulaires des feuilles attachées. En conséquence, nous avons réalisé la transformation transitoire médiée par Agrobacterium in planta des feuilles de cacao attachées exprimant pour le système rapporteur Ruby. Il s’agit également de la première transformation transitoire du cacao par Agrobacterium in planta . Ce protocole permettrait l’application de la méthode d’agroinfiltration sous vide à d’autres espèces végétales ayant des contraintes de taille similaires et ouvrirait la porte à la caractérisation in planta des gènes chez des espèces ligneuses récalcitrantes de grande taille.
Introduction
Les méthodes de transformation génétique végétale sont essentielles pour tester les fonctions biologiques des gènes et sont particulièrement utiles aujourd’hui compte tenu du grand nombre de gènes non caractérisés prédits dans l’ère post-génomique1. Ces méthodes peuvent être utilisées pour obtenir des lignées entièrement transformées ou pour exprimer des gènes de manière transitoire. La transformation stable se produit lorsque l’ADN étranger que l’hôte a absorbé s’intègre complètement et irréversiblement dans le génome de l’hôte, et que les modifications génétiques sont transmises aux générations suivantes. L’expression transitoire, connue sous....
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Protocole
1. Culture d’Agrobacterium tumefaciens
- Décongeler les cellules électrocompétentes de la souche LBA4404 d’Agrobacterium tumefaciens .
- Ajouter 1 mL de malt de levure (YM ; Tableau 1) dans un tube de culture de 17 mm x 100 mm. Conservez ce tube pour plus tard et conservez-le à température ambiante (RT).
- Dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter 30 μL de cellules Agrobacterium décongelées et 100-250 ng (jusqu’à 5 μL) d’ADN contenant 35S :RUBY. Mélangez doucement.
NOTE : Le 35S :RUBY était un cadeau de Yunde Zhao. Pour éviter la formation d’a....
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Résultats
Ce protocole présente une méthode d’agroinfiltration efficace pour les plantes ligneuses de grande taille. Avec ce protocole, nous avons pu atteindre une pression de vide de -0,07 MPa, ce qui a permis une infiltration efficace et localisée des feuilles de cacaoyer. Sur la figure 4, nous observons le processus de mise en place du système d’infiltration, et sur la figure 5, la configuration finale.
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Discussion
Dans ce travail, nous avons présenté un protocole d’agroinfiltration efficace et peu coûteux pour la transformation transitoire in planta des plantes ligneuses, en utilisant les plants de cacao comme exemple. Compte tenu de la contrainte bien connue que représente la cuticule des feuilles pour la transformation des tissus végétaux, nous nous sommes concentrés sur le développement d’une stratégie pour faciliter l’agroinfiltration par vide chez les plantes ligneuses, habituellement récalcitrantes à cette procédure.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions Lic. Jesús Fuentes González et Néstor Iván Robles Olivares pour leur aide dans le tournage de la séquence vidéo. Nous remercions le Dr Antonia Gutierrez Mora de CIATEJ (plantes de cacao Theobroma ) pour ses généreux dons. Nous remercions également CIATEJ et Laboratorio Nacional PlanTECC, Mexique, pour leur soutien à l’installation. S.E.H.D. (CVU : 1135375) a mené des études de master avec le financement du Consejo Nacional de Humanidades, Ciencia y Tecnología, Mexique (CONAHCYT). R.U.L. remercie le Consejo Estatal de Ciencia y Tecnología de Jalisco (COECYTJAL) et le Secretaría de Innovación Ciencia y Tecnología (SICYT), Jalisco, Mexique (subve....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 35S :RUBY plasmide | Addgene | 160908 | http://n2t.net/addgene:160908 ; RRID :Addgene_160908 |
| cuvette d’électroporation de 1 mm | Thermo Fisher Scientific ; | FB101 | Fisherbrand ; Cuvettes d’électroporation Plus |
| Dessiccateur | Bel-Art SP SCIENCEWARWE | F42400-2121 | |
| Lyophilisateur | LABCONCO | 700402040 | |
| K2HPO4 | Sigma Aldrich | P8281-500G | Pour YM medium, ajouter 0,38 g/L |
| LBA4404 ElectroCompetent Agrobacterium | Intact Genomics USA | 1285-12 | https://intactgenomics.com/product/lba4404-electrocompetent-agrobacterium/ |
| Mannitol | Sigma Aldrich | 63560-250G-F | Pour le milieu YM, ajouter 10 g/L |
| MES | Sigma Aldrich | PHG0003 | (Pour LB, YM et milieu de remise en suspension) ajouter 1,95 g/L (10 mM) |
| MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Pour le milieu de remise en suspension, ajouter 0,952 g/L (10 mM) |
| MgSO4· ; 7H20 | Sigma Aldrich | 63138-1KG | Pour le support YM, ajouter 0,204 g/L |
| MicroPulser Appareil d’électroporation | Biorad ; | 165-2100 | |
| NaCl | Karal | 60552 | Pour LB medium, ajouter 5 g/L ; Pour le support YM, ajouter 0,1 g/L |
| NanoDrop One Microvolume Spectrophotomètre UV-Vis | Thermo Fisher Scientific ; | 13-400-518 | |
| President Silicone Matériau d’empreinte | COLTENE | 60019938 | |
| rifampicine ; | Gold-Bio | R-120-1 | (100 mg/mL) |
| Silicone Matériau d’empreinte pistolet | Andent TBT06 | ||
| Spectinomycine | Gold-Bio | S-140-SL10 | (100 mg/mL) |
| Streptomycine | Gold-Bio | S-150-SL10 | (100 mg/mL) |
| Tryptone enzymatique digest à partir de caséine | Sigma Aldrich | 95039-1KG-F | Pour le milieu LB, ajoutez 10 g/L |
| Levure extrait | MCD LAB | 9031 | Pour le milieu LB, ajouter 5 g/L ; Pour le milieu YM, ajouter 0,4 g/L |
Références
- Huang, L. Q. Functional Genome of Medicinal Plants. Molecular Pharmacognosy. , Springer, Singapore. (2019).
- Janssen, B. J., Gardner, R. C. Localized transient expression of GUS in leaf discs following cocultivation with Agrobacterium. Plant Molecular Biology. 14 (1), 61-72 (1990).
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Réimpressions et autorisations
