En acetyl-klik kemi assay til måling af histon acetyltransferase 1 acetylering

Summary

Hurtige og præcise kemiske assays til screening for specifikke hæmmere er et vigtigt værktøj i arsenalet af lægemiddeludvikling. Her præsenterer vi et skalerbart acetyl-klik-kemiassay til måling af hæmningen af HAT1-acetyleringsaktivitet.

Abstract

HAT1, også kendt som histonacetyltransferase 1, spiller en afgørende rolle i kromatinsyntese ved at stabilisere og acetylere spirende H4 før nukleosomsamling. Det er nødvendigt for tumorvækst i forskellige systemer, hvilket gør det til et potentielt mål for kræftbehandling. For at lette identifikationen af forbindelser, der kan hæmme HAT1 enzymatisk aktivitet, har vi udtænkt et acetyl-klik-assay til hurtig screening. I denne enkle analyse anvender vi rekombinant HAT1 / Rbap46, som renses fra aktiverede humane celler. Metoden anvender acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klik-kemi tilgang. Dette involverer enzymatisk overførsel af et alkynhåndtag gennem en HAT1-afhængig acyleringsreaktion til et biotinyleret H4 N-terminalt peptid. Det fangede peptid immobiliseres derefter på neutravidinplader efterfulgt af klikkemifunktionalisering med biotinazid. Derefter anvendes streptavidin-peroxidaserekruttering til at oxidere amplex rød, hvilket resulterer i en kvantitativ fluorescerende udgang. Ved at indføre kemiske hæmmere under acyleringsreaktionen kan vi kvantificere enzymatisk hæmning baseret på en reduktion af fluorescenssignalet. Det er vigtigt, at denne reaktion er skalerbar, hvilket muliggør screening med høj gennemstrømning af potentielle hæmmere for HAT1 enzymatisk aktivitet.

Introduction

Blandt de mange eukaryote acetyltransferaser var HAT1 den oprindelige histonacetyltransferase, der skulle isoleres ^1,2,3. Efterfølgende undersøgelser har fast etableret sin centrale rolle i kromatinreplikation, især i syntesen af nye nukleosomer under S-fase⁴. Vores forskningsbestræbelser førte til erkendelsen af, at HAT1 i høj grad stimuleres af epidermal vækstfaktor (EGF) behandling i brystceller⁵. Desuden er det kommet frem, at HAT1 er nødvendig for hurtig celleproliferation og tumordannelse in vivo 6,7,8,9. Data indikerer, at HAT1 er afgørende for at koordinere anabolske og epigenetiske processer til celledeling, hvilket driver tumorvækst.

HAT1 di-acetylerer den aminoterminale hale af histon H4 på lysiner 5 og 12 i kompleks med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen og præsenterer aminoterminalen til HAT1. Histontetramerer eller disomer¹⁰ sammen med HAT1/Rbap46 og andre histonchaperoner¹¹ importeres derefter til kernen. Histoner frigives derefter for at blive deponeret ved replikationsgaflen eller andre steder for at understøtte genaktivering eller undertrykkelse. Funktionen af HAT1-di-acetyleringsmærket på histon H4 forstås ikke fuldt ud. Det fjernes sandsynligvis hurtigt inden for et tidsrum på 15-30 minutter ved virkningen af histondeacetylaser 12,13,14,15 efter H4 er indsat i kromatin. Således formeres HAT1-di-acetyleringsmærket ikke i kromatin og tjener muligvis ikke en ægte epigenetisk rolle, selvom en rolle i rekrutteringen af kromatinmodificerende enzymer til spirende kromatin er blevet postuleret¹². HAT1 acetylerer heller ikke direkte kromatin; Dens aktivitet er begrænset til opløselige histoner.

Udviklingen af småmolekylære histonacetyltransferasehæmmere er blevet hæmmet af uspecifikke analyser med lav kapacitet, hvilket ofte resulterer i dannelsen af biologisk reaktive forbindelser^16,17. Guldstandardanalysen til måling af acetyltransferaseaktiviteter kræver anvendelse af ³H-acetyl-coA, hvilket begrænser gennemstrømningen og kræver stråling. Ikke desto mindre er specifikke og højpotente acetyltransferasehæmmere med små molekyler rettet mod CBP/p300¹⁸ og KAT6A/B^19,20 for nylig blevet beskrevet og bekræftet ved anvendelse af ³H-acetyl-CoA. Fremadrettet udtænkes forbedrede analyser for at opnå bedre gennemstrømning og undgå laboratoriefarer.

Nylige fremskridt inden for acetyleringsovervågning²¹ har brugt klikkemi til at muliggøre enzymatisk reaktionsovervågning. Der er en række klikaktiverede forløbere, der er tilgængelige via enkle syntetiske ruter eller kan købes, der kan inkorporeres i enzymreaktioner. Disse reaktioner udføres typisk i rekombinante systemer, selvom cellebaserede assays også er mulige²². Fordelen ved klikaktiverede co-faktorer og substrater er, at screening direkte kan måle enzymaktivitet uden behov for koblede udlæsningssystemer, der ofte forstyrres af screeningsforbindelser og kræver yderligere håndteringstrin. Dette tillader kun inhibitorbehandlinger under det enzymatiske trin, mens alle nedstrøms funktionaliserings- og detektionstrin udføres efter omfattende vask for at fjerne forbindelser, hvilket begrænser potentialet for assayinterferens. Disse fordele gør designet af klikaktiverede assays at foretrække frem for koblede assays, der almindeligvis er afhængige af påvisning af frit coenzym A.

En vigtig overvejelse er accepten af klikaktiverede co-faktorer i enzymets aktive site. Eksisterende klikaktiverede cofaktorer er muligvis ikke fuldt kompatible med det aktive website, der er optimeret til den oprindelige cofaktor. Strukturel information og modellering kan bruges til at designe aminosyresubstitutioner for at forstørre det aktive sted for at inkorporere ændrede substrater²³. Dette kan muliggøre screening med forbedret enzymkinetik og lavere substrat- og enzymniveauer. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at ændrede katalytiske lommer muligvis ikke identificerer hæmmere, der interagerer stærkt med det oprindelige enzym. I sidste ende kræves en kombination af tilgange for at identificere og validere potentielle enzymhæmmere.

Her beskriver vi en metode udviklet til at oprense og assay HAT1-enzymaktivitet ved hjælp af klik-co-faktor 4-pentynoyl-CoA²⁴. Dette assay (figur 1) bruger den oprindelige enzymsekvens i kompleks med dets krævede partnerprotein Rbap46, som har vist sig at øge enzymaktiviteten. Oprensning af enzymet fra humane celler muliggør enzymaktivering i cellulo, hvilket kan bevare stimulerende posttranslationelle modifikationer, der er vigtige for fuld enzymaktivitet. Design og optimering af rekombinante enzymassays til kemiske skærme med høj kapacitet er med succes blevet brugt til at identificere og karakterisere HAT1 små molekylehæmmere.

Protocol

1. Metode 1: Fremstilling og rensning af rekombinant HAT1/Rbap46-kompleks Optøning, gendannelse og udvidelse af HEK293f-cellerOptø 1-10 millioner HEK293f pattedyrceller26 i 30 ml freestyle 293 ekspressionsmedier i en 100 ml kolbe. Der inkuberes i 8 % CO2 ved 37 °C, mens der roteres ved 60 omdr./min. Den næste dag skal du tælle og kontrollere cellelevedygtigheden og derefter justere rotationshastigheden til 120 o / min. Udvid til 300 ml …

Representative Results

Standardkurver i to eksemplarer (16 huller) skal medtages på hver plade for at sikre korrekt analyseydelse. Standardkurvedata bør opstilles i tabelform med et interval på 100% til 0% i henhold til forholdet mellem Pra-holdigt peptid og naturligt H4-peptid i opløsning (tabel 1). Amplex rødt signal vil være det højeste i 100% pra/0% native H4 peptidbrønde, og lavest i 0% pra/100% native H4 peptidbrønde. Efter fluorescens er detekteret, og brønde er gennemsnitlige, skal den resulterende standardgr…

Discussion

I det sidste årti blev klikkemi fremtrædende²⁰, hvilket muliggør præcis design af interagerende kemiske strukturer. Inden for denne sammenhæng har forskellige bioortogonale kovalente forbindelser²¹ vist sig som lovende muligheder for dannelse af komplekser i deres naturlige miljø. Klikkemi anvender par af funktionelle grupper, der udviser hurtige og selektive reaktioner, almindeligvis kendt som “klikreaktioner”. Disse reaktioner forekommer effektivt under miljøvenlig…

Materials

4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher