Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Summary

Schnelle und genaue chemische Assays zum Screening auf bestimmte Inhibitoren sind ein wichtiges Instrument in der Arzneimittelentwicklung. Hier präsentieren wir einen skalierbaren Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Hemmung der HAT1-Acetylierungsaktivität.

Abstract

HAT1, auch bekannt als Histon-Acetyltransferase 1, spielt eine entscheidende Rolle bei der Chromatinsynthese, indem es naszierendes H4 vor dem Nukleosomenaufbau stabilisiert und acetyliert. Es wird für das Tumorwachstum in verschiedenen Systemen benötigt, was es zu einem potenziellen Ziel für die Krebsbehandlung macht. Um die Identifizierung von Verbindungen zu erleichtern, die die enzymatische Aktivität von HAT1 hemmen können, haben wir einen Acetyl-Click-Assay für ein schnelles Screening entwickelt. In diesem einfachen Assay verwenden wir rekombinantes HAT1/Rbap46, das aus aktivierten menschlichen Zellen aufgereinigt wird. Das Verfahren nutzt das Acetyl-CoA-Analogon 4-Pentynoyl-CoA (4P) in einem Click-Chemie-Ansatz. Dabei handelt es sich um den enzymatischen Transfer eines Alkingriffs durch eine HAT1-abhängige Acylierungsreaktion auf ein biotinyliertes H4 N-terminales Peptid. Das eingefangene Peptid wird dann auf Neutravidinplatten immobilisiert, gefolgt von einer Click-Chemie-Funktionalisierung mit Biotin-Azid. Anschließend wird Amplexrot durch Streptavidin-Peroxidase-Rekrutierung oxidiert, was zu einer quantitativen Fluoreszenzleistung führt. Durch das Einbringen chemischer Inhibitoren während der Acylierungsreaktion können wir die enzymatische Hemmung basierend auf einer Verringerung des Fluoreszenzsignals quantifizieren. Wichtig ist, dass diese Reaktion skalierbar ist und ein Hochdurchsatz-Screening potenzieller Inhibitoren auf enzymatische Aktivität von HAT1 ermöglicht.

Introduction

Unter den zahlreichen eukaryotischen Acetyltransferasen war HAT1 die erste Histonacetyltransferase, die isoliert wurde ^1,2,3. Nachfolgende Untersuchungen haben seine zentrale Rolle bei der Chromatinreplikation, insbesondere bei der Synthese neuer Nukleosomen während der S-Phase⁴, fest etabliert. Unsere Forschungsbemühungen führten zu der Erkenntnis, dass HAT1 durch die Behandlung mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) in Brustzellen stark stimuliert wird⁵. Darüber hinaus hat sich herausgestellt, dass HAT1 für die schnelle Zellproliferation und Tumorbildung in vivo benötigt wird 6,7,8,9. Die Daten deuten darauf hin, dass HAT1 entscheidend für die Koordination anaboler und epigenetischer Prozesse für die Zellteilung ist und das Tumorwachstum vorantreibt.

HAT1 diacetyliert den aminoterminalen Schwanz des Histons H4 an den Lysinen 5 und 12 im Komplex mit dem Chaperonprotein Rbap46, das das Histon bindet und den Aminoterminus an HAT1 präsentiert. Histontetramere oder Disome¹⁰ werden dann zusammen mit HAT1/Rbap46 und anderen Histon-Chaperonen¹¹ in den Zellkern importiert. Histone werden dann freigesetzt, um an der Replikationsgabel oder an anderen Stellen abgelagert zu werden, um die Genaktivierung oder -unterdrückung zu unterstützen. Die Funktion der HAT1-Diacetylierungsmarkierung auf Histon H4 ist nicht vollständig verstanden. Es wird wahrscheinlich innerhalb einer Spanne von 15-30 Minuten durch die Wirkung der Histon-Deacetylasen 12,13,14,15 schnell entfernt^, nachdem H4 in das Chromatin eingefügt wurde. Daher wird die HAT1-Diacetylierungsmarkierung im Chromatin nicht propagiert und spielt möglicherweise keine echte epigenetische Rolle, obwohl eine Rolle bei der Rekrutierung von Chromatin-modifizierenden Enzymen für naszierendes Chromatin postuliert wurde¹². Außerdem acetyliert HAT1 Chromatin nicht direkt; seine Aktivität ist auf lösliche Histone beschränkt.

Die Entwicklung von niedermolekularen Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren wurde durch unspezifische Assays und Assays mit niedrigem Durchsatz behindert, was häufig zur Erzeugung biologisch reaktiver Verbindungen führte^16,17. Der Goldstandard-Assay zur Messung der Acetyltransferase-Aktivitäten erfordert die Verwendung von 3-H-Acetyl-coA, was den Durchsatz begrenzt und Strahlung erfordert. Nichtsdestotrotz wurden kürzlich spezifische und hochwirksame niedermolekulare Acetyltransferase-Inhibitoren beschrieben, die auf CBP/p300¹⁸ und KAT6A/B^19,20 abzielen und durch die Verwendung von 3-H-Acetyl-CoA bestätigt wurden. In Zukunft werden verbesserte Assays entwickelt, um einen besseren Durchsatz zu erzielen und Laborgefahren zu vermeiden.

Jüngste Fortschritte in der Acetylierungsüberwachung²¹ haben die Click-Chemie verwendet, um die Überwachung enzymatischer Reaktionen zu ermöglichen. Es gibt eine Vielzahl von klickfähigen Vorläufern, die über einfache Synthesewege zugänglich oder käuflich zu erwerben sind und in Enzymreaktionen eingebaut werden können. Diese Reaktionen werden typischerweise in rekombinanten Systemen durchgeführt, obwohl auch zellbasierte Assays möglich sind²². Der Vorteil von klickfähigen Co-Faktoren und Substraten besteht darin, dass das Screening die Enzymaktivität direkt messen kann, ohne dass gekoppelte Auslesesysteme erforderlich sind, die oft durch das Screening von Verbindungen gestört werden und zusätzliche Handhabungsschritte erfordern. Dies ermöglicht Inhibitorbehandlungen nur während des enzymatischen Schritts, während alle nachgeschalteten Funktionalisierungs- und Detektionsschritte nach umfangreichem Waschen durchgeführt werden, um Verbindungen zu entfernen, wodurch das Potenzial für Assay-Interferenzen begrenzt wird. Diese Vorteile machen das Design von klickfähigen Assays gegenüber gekoppelten Assays vorzuziehen, die üblicherweise auf dem Nachweis von freiem Coenzym A beruhen.

Eine wichtige Überlegung ist die Akzeptanz von klickfähigen Co-Faktoren im aktiven Zentrum des Enzyms. Vorhandene Co-Faktoren mit aktivierten Klicks sind möglicherweise nicht vollständig mit der aktiven Website kompatibel, die für den nativen Co-Faktor optimiert ist. Strukturelle Informationen und Modellierung können verwendet werden, um Aminosäuresubstitutionen zu entwerfen, um das aktive Zentrum zu vergrößern und veränderte Substrate aufzunehmen²³. Dies kann ein Screening mit verbesserter Enzymkinetik und niedrigeren Substrat- und Enzymspiegeln ermöglichen. Der Nachteil dieses Ansatzes besteht darin, dass veränderte katalytische Taschen möglicherweise keine Inhibitoren identifizieren, die stark mit dem nativen Enzym interagieren. Letztendlich ist eine Kombination von Ansätzen erforderlich, um potenzielle Enzyminhibitoren zu identifizieren und zu validieren.

Hier beschreiben wir eine Methode, die entwickelt wurde, um die HAT1-Enzymaktivität mit dem Click-Co-Faktor 4-Pentynoyl-CoA²⁴ zu reinigen und zu testen. Dieser Assay (Abbildung 1) verwendet die native Enzymsequenz im Komplex mit dem erforderlichen Partnerprotein Rbap46, das nachweislich die Enzymaktivität steigert. Die Reinigung des Enzyms aus menschlichen Zellen ermöglicht eine Enzymaktivierung in Cellulo, wodurch stimulierende posttranslationale Modifikationen erhalten bleiben können, die für die volle Enzymaktivität wichtig sind. Das Design und die Optimierung rekombinanter Enzymassays für chemische Hochdurchsatz-Screenings wurden erfolgreich zur Identifizierung und Charakterisierung von niedermolekularen HAT1-Inhibitoren eingesetzt.

Protocol

1. Methode 1: Herstellung und Aufreinigung des rekombinanten HAT1/Rbap46-Komplexes Auftauen, Wiederherstellen und Expandieren von HEK293f-ZellenAuftauen von 1-10 Millionen HEK293f-Säugetierzellen26 in 30-ml-Freestyle-293-Expressionsmedien in einem 100-ml-Kolben. Inkubieren Sie in 8 % CO2 bei 37 °C und drehen Sie bei 60 U/min. Zählen und überprüfen Sie am nächsten Tag die Lebensfähigkeit der Zellen und stellen Sie dann die Rotationsges…

Representative Results

Standardkurven in doppelter Ausführung (16 Wells) sollten auf jeder Platte enthalten sein, um eine ordnungsgemäße Testleistung zu gewährleisten. Die Standardkurvendaten sollten in Tabellenform mit einem Bereich von 100 % bis 0 % entsprechend dem Verhältnis von Pra-haltigem Peptid zu nativem H4-Peptid in Lösung erstellt werden (Tabelle 1). Das rote Signal von Amplex ist das höchste in 100 % pra/0 % nativen H4-Peptid-Wells und das niedrigste in 0 % pra/100 % nativen H4-Peptid-Wells. Nachdem die Fluo…

Discussion

In den letzten zehn Jahren wurde die Klickchemie prominent²⁰ und ermöglichte das präzise Design wechselwirkender chemischer Strukturen. In diesem Zusammenhang haben sich verschiedene bioorthogonale kovalente Verbindungen²¹ als vielversprechende Optionen für die Bildung von Komplexen in ihrer natürlichen Umgebung herausgestellt. Die Click-Chemie verwendet Paare funktioneller Gruppen, die schnelle und selektive Reaktionen zeigen, die allgemein als “Click-Reaktionen” bekan…

Materials

4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher