हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ 1 एसिटिलेशन को मापने के लिए एक एसिटाइल-क्लिक रसायन विज्ञान परख
Summary
विशिष्ट अवरोधकों के लिए स्क्रीन पर त्वरित और सटीक रासायनिक परख दवा विकास शस्त्रागार में एक महत्वपूर्ण उपकरण हैं। यहां, हम HAT1 एसिटिलेशन गतिविधि के निषेध को मापने के लिए एक स्केलेबल एसिटाइल-क्लिक रसायन विज्ञान परख प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
HAT1, जिसे हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ 1 के रूप में भी जाना जाता है, न्यूक्लियोसोम असेंबली से पहले नवजात H4 को स्थिर और एसिटाइलेट करके क्रोमैटिन संश्लेषण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह विभिन्न प्रणालियों में ट्यूमर के विकास के लिए आवश्यक है, जिससे यह कैंसर के उपचार के लिए एक संभावित लक्ष्य बन जाता है। यौगिकों की पहचान को सुविधाजनक बनाने के लिए जो HAT1 एंजाइमेटिक गतिविधि को रोक सकते हैं, हमने तेजी से स्क्रीनिंग के लिए एसिटाइल-क्लिक परख तैयार की है। इस सरल परख में, हम पुनः संयोजक HAT1/Rbap46 को नियोजित करते हैं, जो सक्रिय मानव कोशिकाओं से शुद्ध होता है। विधि क्लिक-रसायन विज्ञान दृष्टिकोण में एसिटाइल-सीओए एनालॉग 4-पेंटीनॉयल-सीओए (4 पी) का उपयोग करती है। इसमें बायोटिनिलेटेड एच 4 एन-टर्मिनल पेप्टाइड के लिए एचएटी 1-निर्भर एसीलेशन प्रतिक्रिया के माध्यम से एक एल्काइन हैंडल का एंजाइमेटिक हस्तांतरण शामिल है। कैप्चर किए गए पेप्टाइड को तब न्यूट्रैविडिन प्लेटों पर स्थिर किया जाता है, इसके बाद बायोटिन-एज़ाइड के साथ क्लिक-केमिस्ट्री फंक्शनलाइज़ेशन होता है। इसके बाद, स्ट्रेप्टाविडिन-पेरोक्सीडेज भर्ती को एम्पलेक्स लाल ऑक्सीकरण करने के लिए नियोजित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप मात्रात्मक फ्लोरोसेंट आउटपुट होता है। एसाइलेशन प्रतिक्रिया के दौरान रासायनिक अवरोधकों को पेश करके, हम प्रतिदीप्ति संकेत की कमी के आधार पर एंजाइमी निषेध की मात्रा निर्धारित कर सकते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, यह प्रतिक्रिया स्केलेबल है, जो HAT1 एंजाइमेटिक गतिविधि के लिए संभावित अवरोधकों की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग की अनुमति देती है।
Introduction
कई यूकेरियोटिक एसिटाइलट्रांसफेरस के बीच, HAT1 1,2,3 को अलग करने वाला प्रारंभिक हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ था। बाद की जांच ने क्रोमैटिन प्रतिकृति में अपनी महत्वपूर्ण भूमिका को मजबूती से स्थापित किया है, विशेष रूप से एस-चरण4 के दौरान नए न्यूक्लियोसोम के संश्लेषण में। हमारे शोध प्रयासों ने मान्यता दी कि एचएटी 1 स्तन कोशिकाओं में एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) उपचार द्वारा अत्यधिक उत्तेजित है5. इसके अलावा, यह प्रकाश में आया है कि एचएटी 1 तेजी से सेल प्रसार और विवो 6,7,8,9 में ट्यूमर गठन के लिए आवश्यक है। डेटा से संकेत मिलता है कि HAT1 कोशिका विभाजन के लिए एनाबॉलिक और एपिजेनेटिक प्रक्रियाओं के समन्वय में महत्वपूर्ण है, जिससे ट्यूमर का विकास होता है।
HAT1 डाइ-एसिटिलेट लाइसिन 4 और 5 पर हिस्टोन H12 की एमिनो-टर्मिनल पूंछ को चैपरोन प्रोटीन Rbap46 के साथ जटिल बनाता है, जो हिस्टोन को बांधता है और HAT1 को एमिनो-टर्मिनस प्रस्तुत करता है। हिस्टोन टेट्रामर्स या डाइसोम10, HAT1/Rbap46 और अन्य हिस्टोन चैपरोन11 के साथ, फिर नाभिक में आयात किए जाते हैं। हिस्टोन को तब प्रतिकृति कांटा, या जीन सक्रियण या दमन का समर्थन करने के लिए अन्य साइटों पर जमा करने के लिए जारी किया जाता है। हिस्टोन H4 पर HAT1 डाइ-एसिटिलीकरण चिह्न का कार्य पूरी तरह से समझा नहीं गया है। एच 4 को क्रोमैटिन में डालने के बाद हिस्टोन डेसेटाइलस 12,13,14,15 की कार्रवाई से 15-30 मिनट की अवधि के भीतर इसे जल्दी से हटा दिया जाता है। इस प्रकार, HAT1 di-acetylation चिह्न क्रोमैटिन में प्रचारित नहीं है और नवजात क्रोमैटिन के लिए क्रोमैटिन संशोधित एंजाइमों की भर्ती में एक भूमिका12 पोस्ट किया गया है, हालांकि एक सच्चे epigenetic भूमिका की सेवा नहीं हो सकता है. इसके अलावा, HAT1 सीधे क्रोमैटिन को एसीटिलेट नहीं करता है; इसकी गतिविधि घुलनशील हिस्टोन तक ही सीमित है।
छोटे-अणु हिस्टोन एसिटाइलट्रांसफेरेज़ अवरोधकों के विकास को निरर्थक और कम-थ्रूपुट परख द्वारा बाधित किया गया है, जिसके परिणामस्वरूप अक्सर जैविक रूप से प्रतिक्रियाशील यौगिकों की पीढ़ी होती है 16,17. एसिटाइलट्रांसफेरेज़ गतिविधियों को मापने के लिए स्वर्ण-मानक परख को 3एच-एसिटाइल-सीओए के उपयोग की आवश्यकता होती है, जो थ्रूपुट को सीमित करता है और विकिरण की आवश्यकता होती है। बहरहाल, हाल ही में, सीबीपी / पी 30018 और केएटी 6 ए / बी19,20 को लक्षित करने वाले विशिष्ट और अत्यधिक शक्तिशाली छोटे अणु एसिटाइलट्रांसफेरेज़ अवरोधकों को 3एच-एसिटाइल-सीओए के उपयोग के माध्यम से वर्णित और पुष्टि की गई है। आगे बढ़ते हुए, बेहतर थ्रूपुट प्राप्त करने और प्रयोगशाला के खतरों से बचने के लिए बेहतर परख तैयार की जा रही है।
एसिटिलीकरण निगरानी21 में हाल के अग्रिमों एंजाइमी प्रतिक्रिया निगरानी सक्षम करने के लिए क्लिक रसायन विज्ञान का इस्तेमाल किया है. क्लिक-सक्षम अग्रदूतों की एक किस्म है जो सरल सिंथेटिक मार्गों द्वारा सुलभ हैं या खरीद के लिए उपलब्ध हैं जिन्हें एंजाइम प्रतिक्रियाओं में शामिल किया जा सकता है। इन प्रतिक्रियाओं आम तौर पर पुनः संयोजक प्रणालियों में किया जाता है, हालांकि सेल आधारित assays भीसंभव 22 कर रहे हैं. क्लिक-सक्षम सह-कारकों और सब्सट्रेट का लाभ यह है कि स्क्रीनिंग सीधे युग्मित रीड-आउट सिस्टम की आवश्यकता के बिना एंजाइम गतिविधि को माप सकती है जो अक्सर स्क्रीनिंग यौगिकों से परेशान होती है और अतिरिक्त हैंडलिंग चरणों की आवश्यकता होती है। यह केवल एंजाइमी कदम के दौरान अवरोधक उपचार के लिए अनुमति देता है, जबकि सभी डाउनस्ट्रीम फंक्शनलाइजेशन और डिटेक्शन चरणों को यौगिकों को हटाने के लिए व्यापक धोने के बाद किया जाता है, इस प्रकार परख हस्तक्षेप होने की संभावना को सीमित करता है। ये फायदे क्लिक-सक्षम परख के डिजाइन को युग्मित परख के लिए बेहतर बनाते हैं जो आमतौर पर मुक्त कोएंजाइम ए का पता लगाने पर भरोसा करते हैं।
एक महत्वपूर्ण विचार एंजाइम सक्रिय साइट में क्लिक-सक्षम सह-कारकों की स्वीकृति है। मौजूदा क्लिक-सक्षम सह-कारक मूल सह-कारक के लिए अनुकूलित सक्रिय साइट के साथ पूरी तरह से संगत नहीं हो सकते हैं। संरचनात्मक जानकारी और मॉडलिंग का उपयोग अमीनो एसिड प्रतिस्थापन डिजाइन करने के लिए किया जा सकता है ताकि परिवर्तित सब्सट्रेट23 को शामिल करने के लिए सक्रिय साइट को बढ़ाया जा सके। यह बेहतर एंजाइम कैनेटीक्स और कम सब्सट्रेट और एंजाइम के स्तर के साथ स्क्रीनिंग को सक्षम कर सकता है। इस दृष्टिकोण का दोष यह है कि परिवर्तित उत्प्रेरक जेब अवरोधकों की पहचान नहीं कर सकते हैं जो देशी एंजाइम के साथ दृढ़ता से बातचीत करते हैं। अंततः, संभावित एंजाइम अवरोधकों की पहचान करने और मान्य करने के लिए दृष्टिकोण के संयोजन की आवश्यकता होती है।
यहां, हम क्लिक सह-कारक 4-पेंटीनॉयल-सीओए24 का उपयोग करके HAT1 एंजाइम गतिविधि को शुद्ध और परख करने के लिए विकसित एक विधि का वर्णन करते हैं। यह परख (चित्रा 1) एंजाइम गतिविधि को बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया है जो अपने आवश्यक साथी प्रोटीन Rbap46, के साथ जटिल में देशी एंजाइम अनुक्रम का उपयोग करता है. मानव कोशिकाओं से एंजाइम की शुद्धि सेलूलो में एंजाइम सक्रियण के लिए अनुमति देती है, जो पूर्ण एंजाइम गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों को उत्तेजित कर सकती है। उच्च थ्रूपुट रासायनिक स्क्रीन के लिए पुनः संयोजक एंजाइम परख के डिजाइन और अनुकूलन का उपयोग HAT1 छोटे अणु अवरोधकों की पहचान करने और उन्हें चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
पिछले दशक में, क्लिक रसायन विज्ञान प्रमुख20 बन गया, जिससे रासायनिक संरचनाओं के अंतःक्रियात्मक सटीक डिजाइन को सक्षम किया गया। इस संदर्भ में, विभिन्न बायोऑर्थोगोनल सहसंयोजक कनेक्शन21 अ…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम H4K12CoA प्रदान करने के लिए जॉर्ज झेंग को धन्यवाद देते हैं। हम उपयोगी चर्चा और प्रतिक्रिया के लिए ग्रुबर लैब के सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। हम एनआईएच/एनसीआई (1K08CA245024), CPRIT (RR200090), और V फाउंडेशन (V2022-022) के समर्थन का धन्यवाद करते हैं।
Materials
| 4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
| Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
| Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
| Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
| DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
| DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
| Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
| Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
| Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
| H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
| HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
| Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
| M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
| Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
| Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
| NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
| pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
| Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
| Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
| Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
| Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
| Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
| Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
| Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
| THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
| Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
| Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
| Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
| Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |
References
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