Un test de chimie acétyl-clic pour mesurer l’acétylation de l’histone acétyltransférase 1

Résumé

Des tests chimiques rapides et précis pour dépister des inhibiteurs spécifiques sont un outil important dans l’arsenal de développement de médicaments. Ici, nous présentons un test de chimie acétyl-click évolutif pour mesurer l’inhibition de l’activité d’acétylation de HAT1.

Résumé

HAT1, également connue sous le nom d’histone acétyltransférase 1, joue un rôle crucial dans la synthèse de la chromatine en stabilisant et en acétylant le H4 naissant avant l’assemblage des nucléosomes. Il est nécessaire à la croissance tumorale dans divers systèmes, ce qui en fait une cible potentielle pour le traitement du cancer. Pour faciliter l’identification des composés capables d’inhiber l’activité enzymatique de HAT1, nous avons mis au point un test acétyl-click pour un criblage rapide. Dans ce test simple, nous utilisons HAT1/Rbap46 recombinant, qui est purifié à partir de cellules humaines activées. La méthode utilise l’analogue de l’acétyl-CoA 4-pentynoyl-CoA (4P) dans une approche de chimie click. Il s’agit du transfert enzymatique d’une poignée d’alcyne par une réaction d’acylation dépendante de HAT1 à un peptide N-terminal H4 biotinylé. Le peptide capturé est ensuite immobilisé sur des plaques de neutravidines, suivi d’une fonctionnalisation par chimie click avec de l’azoture de biotine. Par la suite, le recrutement de la streptavidine-peroxydase est utilisé pour oxyder le rouge d’amplex, ce qui donne une sortie fluorescente quantitative. En introduisant des inhibiteurs chimiques pendant la réaction d’acylation, nous pouvons quantifier l’inhibition enzymatique en fonction d’une réduction du signal de fluorescence. Il est important de noter que cette réaction est évolutive, ce qui permet un criblage à haut débit d’inhibiteurs potentiels de l’activité enzymatique HAT1.

Introduction

Parmi les nombreuses acétyltransférases eucaryotes, HAT1 était l’histone acétyltransférase initiale à être isolée ^1,2,3. Des recherches ultérieures ont fermement établi son rôle central dans la réplication de la chromatine, en particulier dans la synthèse de nouveaux nucléosomes au cours de la phase^{S 4}. Nos efforts de recherche ont permis de reconnaître que HAT1 est fortement stimulé par le traitement par facteur de croissance épidermique (EGF) dans les cellules mammaires⁵. De plus, il est apparu que HAT1 est nécessaire à la pro....

Protocole

1. Méthode 1 : Production et purification du complexe recombinant HAT1/Rbap46

1. Décongélation, récupération et expansion des cellules HEK293f
   1. Décongeler 1 à 10 millions de cellules de mammifères HEK293f²⁶ dans des milieux d’expression libres 293 de 30 mL dans une fiole de 100 mL. Incuber dans 8% de CO₂ à 37 °C en tournant à 60 tr/min.
   2. Le lendemain, comptez et vérifiez la viabilité des cellules, puis ajustez la vitesse de rotation à 120 tr/min. Étendre à 300 mL de culture dans une fiole de 1 L, en maintenant la densité d’ensemencement à 500 000 cellules/mL et en divisant les cellules avant qu....

Résultats

Des courbes standard en double (16 puits) doivent être incluses sur chaque plaque pour garantir une bonne performance d’analyse. Les données de la courbe standard doivent être présentées sous forme de tableau, avec une fourchette de 100 % à 0 % selon le rapport entre le peptide contenant du pra et le peptide H4 natif en solution (tableau 1). Le signal rouge Amplex sera le plus élevé dans les puits de peptides H4 100 % pra/0 % natif, et le plus bas dans les puits peptidiques H4 0 % pra/100 % natifs. Une f.......

Discussion

Au cours de la dernière décennie, la chimie click a pris de l’importance²⁰, permettant la conception précise de structures chimiques en interaction. Dans ce contexte, diverses connexions covalentes bioorthogonales²¹ sont apparues comme des options prometteuses pour former des complexes dans leur environnement naturel. La chimie click utilise des paires de groupes fonctionnels qui présentent des réactions rapides et sélectives, communément appelées « réactions click ». Ces r.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4P CoA	Cayman Chemical	10547	Chimie clic cofacteur
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Substrat de fluorescence
Biotine-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Chimie clic
Sulfate de cuivre	Sigma-aldrich	; 7758-98-7	Chimie click
DMSO	Fisher Scientific	; 67-68-5	diluant
DTT	Acros Organics	03-12-3483	agent réducteur
Forskolin	VWR	102987-310	Expression protéique
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cellules	Thermo Fisher	R790-07	Expression protéique
H4-peptide/1-23-GGK-biotine	Anaspec	substrat peptidique	AS65097
HEPES	Sigma-aldrich	; 7365-45-9	Tampon EB
Peroxyde d’hydrogène solution à 30 %	Sigma-aldrich	; Z00183-99-0	initiateur
M2 FLAG suspension d’anticorps	Millipore-Sigma	A2220	Purification des protéines
Filtre Macrosep 10K (Pall Lab)	VWR	89131-980	Purification des protéines
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x tampon
pHEK-293 plasmide	Takara Bio	3390	Expression protéique
Phosphate Tamponné Saline 10x	Alfa Aesar	; Z00082-33-6	tampon de lavage
Peptide	Pra Genscript	Synthèse personnalisée	biotinylé
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	; 134-03-2	Chimie click
Chlorure de sodium	Sigma-aldrich	; 7647-14-5	Tampon EB
Phosphate de sodium	VWR International	7558-80-7
Tampon Streptavidine	EMD Millipore	189730	concurrent
Streptavidin-HRP	Signalisation cellulaire	3999S	enzyme
THPTA	ligand Fisher Sci	1010-500	Chimie clic
Base Tris	Sigma-aldrich	; 77-86-1	20x tampon
Triton-X 100	VWR International	; 9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	; 9005-64-5	Tampon de lavage
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	désaltérant