En acetyl-klikk-kjemianalyse for å måle histonacetyltransferase 1-acetylering

Summary

Raske og nøyaktige kjemiske analyser for å skjerme for spesifikke hemmere er et viktig verktøy i stoffutviklingsarsenalet. Her presenterer vi en skalerbar acetyl-klikk-kjemianalyse for å måle inhiberingen av HAT1-acetyleringsaktivitet.

Abstract

HAT1, også kjent som histonacetyltransferase 1, spiller en avgjørende rolle i kromatinsyntese ved å stabilisere og acetylere begynnende H4 før nukleosommontering. Det er nødvendig for tumorvekst i ulike systemer, noe som gjør det til et potensielt mål for kreftbehandling. For å lette identifiseringen av forbindelser som kan hemme HAT1 enzymatisk aktivitet, har vi utviklet en acetyl-klikk-analyse for rask screening. I denne enkle analysen bruker vi rekombinant HAT1 / Rbap46, som er renset fra aktiverte humane celler. Metoden benytter acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klikk-kjemi tilnærming. Dette innebærer enzymatisk overføring av et alkynhåndtak gjennom en HAT1-avhengig acyleringsreaksjon til et biotinylert H4N-terminalt peptid. Det fangede peptidet immobiliseres deretter på nøytravidinplater, etterfulgt av klikk-kjemisk funksjonalisering med biotin-azid. Deretter brukes streptapavidin-peroksidase rekruttering for å oksidere amplex rødt, noe som resulterer i en kvantitativ fluorescerende utgang. Ved å introdusere kjemiske hemmere under acyleringsreaksjonen, kan vi kvantifisere enzymatisk inhibering basert på en reduksjon av fluorescenssignalet. Det er viktig at denne reaksjonen er skalerbar, noe som muliggjør høy gjennomstrømningsscreening av potensielle hemmere for HAT1-enzymatisk aktivitet.

Introduction

Blant de mange eukaryote acetyltransferasene var HAT1 den første histonacetyltransferasen som ble isolert ^1,2,3. Etterfølgende undersøkelser har fast etablert sin sentrale rolle i kromatinreplikasjon, spesielt i syntesen av nye nukleosomer under S-fase⁴. Våre forskningsbestrebelser førte til erkjennelsen av at HAT1 er sterkt stimulert av epidermal vekstfaktor (EGF) behandling i brystceller⁵. Videre har det kommet frem at HAT1 er nødvendig for rask celleproliferasjon og tumordannelse in vivo 6,7,8,9. Data indikerer at HAT1 er kritisk for å koordinere anabole og epigenetiske prosesser for celledeling, som driver tumorvekst.

HAT1 di-acetylerer den aminoterminale halen av histon H4 på lysiner 5 og 12 i kompleks med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen og presenterer aminoterminalen til HAT1. Histontetramere eller disomer¹⁰, sammen med HAT1/Rbap46 og andre histonchaperoner¹¹, importeres deretter til kjernen. Histoner frigjøres deretter for å bli deponert ved replikasjonsgaffelen eller andre steder for å støtte genaktivering eller undertrykkelse. Funksjonen til HAT1-di-acetyleringsmerket på histon H4 er ikke fullt ut forstått. Det er sannsynligvis raskt fjernet i løpet av et tidsrom på 15-30 min ved virkningen av histondeacetylaser 12,13,14,15 etter at H4 er satt inn i kromatin. Dermed er HAT1-di-acetyleringsmerket ikke forplantet i kromatin og kan ikke tjene en ekte epigenetisk rolle, selv om en rolle i rekrutteringen av kromatinmodifiserende enzymer til begynnende kromatin har blitt postulert¹². HAT1 acetylat kromatin direkte; Dens aktivitet er begrenset til løselige histoner.

Utviklingen av småmolekylære histonacetyltransferasehemmere har blitt hemmet av ikke-spesifikke og lavkapasitetsanalyser, noe som ofte resulterer i generering av biologisk reaktive forbindelser^16,17. Gullstandardanalysen for å måle acetyltransferaseaktiviteter krever bruk av ³H-acetyl-coA, som begrenser gjennomstrømningen og krever stråling. Ikke desto mindre har nylig spesifikke og svært potente småmolekylære acetyltransferasehemmere rettet mot CBP / p300¹⁸ og KAT6A / B^19,20 blitt beskrevet og bekreftet ved bruk av ³H-acetyl-CoA. Fremover blir forbedrede analyser for å oppnå bedre gjennomstrømning og unngå laboratoriefarer utarbeidet.

Nylige fremskritt innen acetyleringsovervåking²¹ har brukt klikkkjemi for å muliggjøre enzymatisk reaksjonsovervåking. Det finnes en rekke klikkaktiverte forløpere som er tilgjengelige via enkle syntetiske ruter eller tilgjengelig for kjøp som kan inkorporeres i enzymreaksjoner. Disse reaksjonene utføres vanligvis i rekombinante systemer, selv om cellebaserte analyser også er mulige²². Fordelen med klikkaktiverte kofaktorer og substrater er at screening direkte kan måle enzymaktivitet uten behov for koblede avlesningssystemer som ofte forstyrres av screeningforbindelser og krever ytterligere håndteringstrinn. Dette tillater inhibitorbehandlinger bare under det enzymatiske trinnet, mens alle nedstrøms funksjonaliserings- og deteksjonstrinn utføres etter omfattende vask for å fjerne forbindelser, og dermed begrense potensialet for at analyseinterferens oppstår. Disse fordelene gjør utformingen av klikkaktiverte analyser å foretrekke fremfor koblede analyser som vanligvis er avhengige av påvisning av fritt koenzym A.

En viktig faktor er aksept av klikkaktiverte kofaktorer i det enzymaktive nettstedet. Eksisterende klikkaktiverte kofaktorer er kanskje ikke helt kompatible med det aktive nettstedet som er optimalisert for den opprinnelige kofaktoren. Strukturell informasjon og modellering kan brukes til å designe aminosyresubstitusjoner for å forstørre det aktive stedet for å innlemme endrede substrater²³. Dette kan muliggjøre screening med forbedret enzymkinetikk og lavere substrat- og enzymnivåer. Ulempen med denne tilnærmingen er at endrede katalytiske lommer kanskje ikke identifiserer hemmere som interagerer sterkt med det opprinnelige enzymet. Til syvende og sist er det nødvendig med en kombinasjon av tilnærminger for å identifisere og validere potensielle enzymhemmere.

Her beskriver vi en metode utviklet for å rense og analysere HAT1-enzymaktivitet ved bruk av klikk-kofaktor 4-pentynoyl-CoA²⁴. Denne analysen (figur 1) bruker den opprinnelige enzymsekvensen i kompleks med det nødvendige partnerproteinet Rbap46, som har vist seg å øke enzymaktiviteten. Rensing av enzymet fra humane celler muliggjør enzymaktivering i cellulo, noe som kan bevare stimulerende posttranslasjonelle modifikasjoner som er viktige for full enzymaktivitet. Design og optimalisering av rekombinante enzymanalyser for kjemiske skjermer med høy gjennomstrømning har med hell blitt brukt til å identifisere og karakterisere HAT1 småmolekylhemmere.

Protocol

1. Metode 1: Produsere og rense rekombinant HAT1 / Rbap46 kompleks Tine, gjenopprette og utvide HEK293f-cellerTine 1-10 millioner HEK293f pattedyrceller26 i 30 ml freestyle 293 uttrykksmedier i en kolbe på 100 ml. Inkuber i 8% CO2 ved 37 ° C mens du roterer ved 60 o / min. Neste dag, tell og kontroller cellens levedyktighet, og juster deretter rotasjonshastigheten til 120 o / min. Utvid til 300 ml kultur i en 1 L kolbe, oppretthold såtett…

Representative Results

Standard kurver i dupliserte (16 brønner) bør inkluderes på hver plate for å sikre riktig analyseytelse. Standard kurvedata bør settes opp i tabellform, med et område på 100% til 0% i henhold til forholdet mellom Pra-inneholdende peptid og native H4-peptid i oppløsning (tabell 1). Amplex rødt signal vil være det høyeste i 100% pra/0% native H4 peptidbrønner, og lavest i 0% pra/100% native H4 peptidbrønner. Etter at fluorescens er påvist og brønner er gjennomsnittet, bør den resulterende s…

Discussion

I løpet av det siste tiåret har klikkkjemi blitt fremtredende²⁰, noe som muliggjør presis utforming av vekselvirkende kjemiske strukturer. Innenfor denne konteksten har ulike bioortogonale kovalente forbindelser²¹ dukket opp som lovende alternativer for å danne komplekser i sitt naturlige miljø. Klikkkjemi benytter par av funksjonelle grupper som viser raske og selektive reaksjoner, kjent som “klikkreaksjoner”. Disse reaksjonene forekommer effektivt under miljøvennlig…

Materials

4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher