En acetylklickkemianalys för att mäta histonacetyltransferas 1-acetylering

Summary

Snabba och noggranna kemiska analyser för att screena för specifika hämmare är ett viktigt verktyg i läkemedelsutvecklingsarsenalen. Här presenterar vi en skalbar acetylklickkemianalys för att mäta hämningen av HAT1-acetyleringsaktiviteten.

Abstract

HAT1, även känt som histonacetyltransferas 1, spelar en avgörande roll i kromatinsyntesen genom att stabilisera och acetylera begynnande H4 före nukleosommontering. Det krävs för tumörtillväxt i olika system, vilket gör det till ett potentiellt mål för cancerbehandling. För att underlätta identifieringen av substanser som kan hämma HAT1 enzymatisk aktivitet har vi tagit fram en acetylklickanalys för snabb screening. I denna enkla analys använder vi rekombinant HAT1/Rbap46, som renas från aktiverade mänskliga celler. Metoden använder acetyl-CoA-analogen 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klickkemisk metod. Detta involverar den enzymatiska överföringen av ett alkynhandtag genom en HAT1-beroende acyleringsreaktion till en biotinylerad H4 N-terminal peptid. Den infångade peptiden immobiliseras sedan på neutravidinplattor, följt av klickkemisk funktionalisering med biotinazid. Därefter används streptavidin-peroxidasrekrytering för att oxidera amplexrött, vilket resulterar i en kvantitativ fluorescerande produktion. Genom att introducera kemiska hämmare under acyleringsreaktionen kan vi kvantifiera enzymatisk hämning baserat på en reduktion av fluorescenssignalen. Det är viktigt att notera att denna reaktion är skalbar, vilket möjliggör screening av potentiella hämmare av HAT1-enzymatisk aktivitet med hög genomströmning.

Introduction

Bland de många eukaryota acetyltransferaserna var HAT1 det första histonacetyltransferaset som isolerades ^1,2,3. Efterföljande undersökningar har fastställt dess centrala roll i kromatinreplikation, särskilt i syntesen av nya nukleosomer under S-fas⁴. Vår forskning ledde till erkännandet att HAT1 stimuleras starkt av behandling med epidermal tillväxtfaktor (EGF) i^{bröstceller5}. Vidare har det framkommit att HAT1 krävs för snabb cellproliferation och tumörbildning in vivo 6,7,8,9. Data indikerar att HAT1 är avgörande för att koordinera anabola och epigenetiska processer för celldelning, vilket driver tumörtillväxt.

HAT1 di-acetylerar den aminoterminala svansen av histon H4 på lysinerna 5 och 12 i komplex med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen och presenterar aminoterminalen för HAT1. Histontetramerer eller disomer¹⁰, tillsammans med HAT1/Rbap46 och andra histonchaperoner¹¹, importeras sedan till kärnan. Histoner frigörs sedan för att deponeras vid replikationsgaffeln eller andra platser för att stödja genaktivering eller repression. Funktionen av HAT1-di-acetyleringsmärket på histon H4 är inte helt klarlagd. Det avlägsnas sannolikt snabbt inom ett spann av 15-30 minuter genom verkan av histondeacetylaser 12,13,14,15 efter att H4 sätts in i kromatin. Således är HAT1-di-acetyleringsmärket inte förökat i kromatin och kan inte tjäna en verklig epigenetisk roll, även om en roll i rekryteringen av kromatinmodifierande enzymer till begynnande kromatin har postulerats¹². HAT1 innehåller inte heller direkt acetylatkromatin; Dess aktivitet är begränsad till lösliga histoner.

Utvecklingen av småmolekylära histonacetyltransferashämmare har hämmats av ospecifika analyser med låg genomströmning, vilket ofta resulterat i generering av biologiskt reaktiva föreningar^16,17. Guldstandardanalysen för att mäta acetyltransferasaktiviteter kräver användning av ³H-acetyl-coA, vilket begränsar genomströmningen och kräver strålning. Icke desto mindre har nyligen specifika och mycket potenta småmolekylära acetyltransferashämmare riktade mot CBP/p300¹⁸ och KAT6A/B^19,20 beskrivits och bekräftats genom användning av ³H-acetyl-CoA. Framöver håller man på att ta fram förbättrade analyser för att uppnå bättre genomströmning och undvika laboratorierisker.

De senaste framstegen inom acetyleringsövervakning²¹ har använt klickkemi för att möjliggöra enzymatisk reaktionsövervakning. Det finns en mängd klickaktiverade prekursorer som är tillgängliga via enkla syntetiska vägar eller finns att köpa som kan införlivas i enzymreaktioner. Dessa reaktioner utförs vanligtvis i rekombinanta system, även om cellbaserade analyser också är möjliga²². Fördelen med klickaktiverade co-faktorer och substrat är att screening direkt kan mäta enzymaktivitet utan behov av kopplade avläsningssystem som ofta störs av screeningföreningar och kräver ytterligare hanteringssteg. Detta möjliggör inhibitorbehandlingar endast under det enzymatiska steget, medan alla nedströms funktionaliserings- och detektionssteg utförs efter omfattande tvättning för att avlägsna föreningar, vilket begränsar risken för att analysinterferens uppstår. Dessa fördelar gör att utformningen av klickaktiverade analyser är att föredra framför kopplade analyser som vanligtvis förlitar sig på detektion av fritt koenzym A.

En viktig faktor är acceptansen av klickaktiverade co-faktorer i enzymets aktiva säte. Befintliga klickaktiverade kofaktorer kanske inte är helt kompatibla med den aktiva webbplatsen som är optimerad för den inbyggda kofaktorn. Strukturell information och modellering kan användas för att designa aminosyrasubstitutioner för att förstora det aktiva stället för att införliva förändrade substrat²³. Detta kan möjliggöra screening med förbättrad enzymkinetik och lägre substrat- och enzymnivåer. Nackdelen med detta tillvägagångssätt är att förändrade katalytiska fickor kanske inte identifierar hämmare som interagerar starkt med det ursprungliga enzymet. I slutändan krävs en kombination av tillvägagångssätt för att identifiera och validera potentiella enzymhämmare.

Här beskriver vi en metod som utvecklats för att rena och analysera HAT1-enzymaktivitet med hjälp av klickkofaktorn 4-pentynoyl-CoA²⁴. Denna analys (figur 1) använder den nativa enzymsekvensen i komplex med dess nödvändiga partnerprotein Rbap46, vilket har visat sig öka enzymaktiviteten. Rening av enzymet från mänskliga celler möjliggör enzymaktivering i cellulo, vilket kan bevara stimulerande posttranslationella modifieringar som är viktiga för full enzymaktivitet. Design och optimering av rekombinanta enzymanalyser för kemiska screeningar med hög genomströmning har framgångsrikt använts för att identifiera och karakterisera HAT1 småmolekylära hämmare.

Protocol

1. Metod 1: Producera och rena rekombinant HAT1/Rbap46-komplex Upptining, återvinning och expansion av HEK293f-cellerTina 1-10 miljoner HEK293f däggdjursceller26 till 30 ml freestyle 293 expressionsmedia i en 100 mL kolv. Inkubera i 8 % CO2 vid 37 °C under rotation med 60 rpm. Nästa dag, räkna och kontrollera cellens viabilitet och justera sedan rotationshastigheten till 120 rpm. Expandera till 300 ml odling i en 1 L kolv, bibehåll så…

Representative Results

Standardkurvor i duplikat (16 brunnar) bör inkluderas på varje platta för att säkerställa korrekt analysprestanda. Standardkurvdata bör ställas in i tabellform, med ett intervall på 100 % till 0 % beroende på förhållandet mellan Pra-innehållande peptid och naturlig H4-peptid i lösning (tabell 1). Amplex röda signal kommer att vara högst i 100 % pra/0 % nativt H4-peptidbrunnar och lägst i 0 % pra/100 % nativt H4-peptidbrunnar. Efter att fluorescens har detekterats och brunnarna har beräkn…

Discussion

Under det senaste decenniet har klickkemi blivit framträdande²⁰, vilket möjliggör exakt design av interagerande kemiska strukturer. I detta sammanhang har olika bioortogonala kovalenta förbindelser²¹ dykt upp som lovande alternativ för att bilda komplex i deras naturliga miljö. Klickkemi använder par av funktionella grupper som uppvisar snabba och selektiva reaktioner, allmänt kända som “klickreaktioner”. Dessa reaktioner sker effektivt under miljövänliga, skonsa…

Materials

4P CoA	Cayman Chemical	10547	Click chemistry co-factor
Amplex Red	Fisher Sci	A12222	Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide	Alfa Aesar	J64996MC	Click chemistry
Copper Sulfate	Sigma-aldrich	7758-98-7	Click chemistry
DMSO	Fisher Scientific	67-68-5	diluent
DTT	Acros Organics	03-12-3483	reducting agent
Forskolin	VWR	102987-310	Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium	Thermo Fisher	12338018	Media
Freestyle 293-F cells	Thermo Fisher	R790-07	Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin	Anaspec	AS65097	peptide substrate
HEPES	Sigma-aldrich	7365-45-9	EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution	Sigma-aldrich	Z00183-99-0	initiator
M2 FLAG antibody slurry	Millipore-Sigma	A2220	Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab)	VWR	89131-980	Protein purification
Neutravidin Plate	Thermo Sci	15127	BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL)	MP Biomedical	198596	20x buffer
pHEK-293 plasmid	Takara Bio	3390	Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x	Alfa Aesar	Z00082-33-6	wash buffer
Pra peptide	Genscript	Custom synthesis	biotinylated
Sodium Ascorbate	Sigma-aldrich	134-03-2	Click chemistry
Sodium chloride	Sigma-aldrich	7647-14-5	EB buffer
Sodium phosphate	VWR International	7558-80-7	buffer
Streptavidin	EMD Millipore	189730	competitor
Streptavidin-HRP	Cell Signaling	3999S	enzyme
THPTA ligand	Fisher Sci	1010-500	Click chemistry
Tris base	Sigma-aldrich	77-86-1	20x buffer
Triton-X 100	VWR International	9002-93-1	EB buffer
Tween-20	Sigma-aldrich	9005-64-5	Wash buffer
Urea	Sigma-Aldrich	57-13-6	quencher