Vi præsenterer en protokol for et glasbaseret, semihydroponisk eksperimentelt system, der understøtter væksten af en række fylogenetisk forskellige planter med eller uden mikrober. Systemet er kompatibelt med forskellige vækstmedier og tillader ikke-destruktiv rodekssudatprøveudtagning til downstream-analyse.
Root exudates former grænsefladen mellem plante og jord, er involveret i næringsstofcyklus og modulerer interaktioner med jordorganismer. Rodekssudater er dynamiske og formet af biologiske, miljømæssige og eksperimentelle forhold. På grund af deres store mangfoldighed og lave koncentrationer er nøjagtige ekssudatprofiler udfordrende at bestemme, endnu mere i naturlige miljøer, hvor andre organismer er til stede, vender planteafledte forbindelser og producerer yderligere forbindelser selv. Det semihydroponiske glasbeholdereksperimentelle system, der introduceres her, tillader kontrol over biologiske, miljømæssige og eksperimentelle faktorer. Det tillader vækst af forskellige fylogenetisk forskellige plantearter i op til flere måneder med eller uden mikrober i en række forskellige vækstmedier. Det glasbaserede design tilbyder en baggrund med lav metabolit for høj følsomhed og lav miljøpåvirkning, da den kan genbruges. Ekssudater kan udtages ikke-destruktivt, og betingelserne kan ændres i løbet af et eksperiment, hvis det ønskes. Opsætningen er kompatibel med massespektrometrianalyse og andre downstream-analyseprocedurer. Sammenfattende præsenterer vi et alsidigt vækstsystem, der er velegnet til følsom rodekssudatanalyse under forskellige forhold.
Inden for tætbefolkede jordarter præsenterer rhizosfæren en kulstofrig niche. Det er formet af planterødder via ekssudation af op til 20% af assimileret kulstof og huser mikrobielle samfund, der adskiller sig fra det hjemmehørende jordmikrobiom 1,2,3,4,5,6. Da forskere udnytter de gavnlige funktioner hos rodassocierede mikrober og potentialet for bæredygtigt landbrug, der følger med det7, har denne observation, ofte betegnet som rhizosfæreeffekten, været fokus for voksende videnskabelig indsats. Indtil videre er den kemiske dialog mellem mikroorganismer og planter, som foreslås at være drivkraften bag rhizosfæreeffekten, imidlertid dårligt forstået, og derfor er den mekanistiske forståelse for udvikling af pålidelige mikrobielle løsninger i landbruget begrænset 8,9,10.
Dekryptering af rodekssudater i jordmiljøer, hvor metabolitter let absorberes af jordpartikler og hurtigt omsættes af mikrobielle samfund, er ikke ligetil, især for plantearter med fine rodsystemer som modelplanten Arabidopsis thaliana11. Dette er grunden til, at rodekssudater i de fleste undersøgelser udtages prøver fra hydroponiske systemer. I disse mikrokosmos holdes luftdele af planter på plads af tilpassede planteholdere eller mere lavmælte materialer som mesh, agar og glasperler. De anvendte beholdere spænder fra petriskåle over multibrøndsplader til forskellige brugerdefinerede og kommercielle kasser med eller uden beluftningsfiltre 12,13,14,15,16,17,18,19. Afhængigt af systemet vil plantevækstbetingelserne variere meget og afspejle naturlige forhold i større eller mindre grad.
Her præsenterer vi et glasbaseret, semihydroponisk system, der er eksperimentelt modtageligt og producerer meget reproducerbare resultater. Det er ligetil at samle og bruge og er baseret på almindeligt tilgængelige materialer. Systemet er baseret på en glasbeholder fyldt med glasperler, der udnytter glasvarernes genanvendelige natur og lavbindende egenskaber (figur 1). Perlerne giver fysisk støtte til den voksende plante og simulerer mekanisk impedans, hvilket bidrager til mere jordlignende rodarkitektur sammenlignet med hydroponiske opsætninger 19,20,21. Hvis de podes med mikrober, præsenterer glasperlerne overflader, som bakterier kan binde sig til.
Glasbeholderen kan lukkes for at opretholde sterilitet, og systemet er designet til at give tilstrækkelig frihøjde og luftcirkulation, så man undgår et miljø, der er mættet med fugt. Krukkerne er velegnede til langvarig vækst af forskellige plantearter og kan skaleres op og ned ved hjælp af krukker i forskellige størrelser. Her vises ansøgninger for seks plantearter, der dækker C3 og C4 græsser, dicots og bælgplanter. Blandt dem er modelarterne A. thaliana (dicot), Brachypodium distachyon (C3 monocot), Medicago truncatula (bælgfrugter) samt afgrødearter som Solanum lycopersicum (tomat, dicot), Triticum aestivum (hvede, C3 monocot) og Sorghum bicolor (sorghum, C4 monocot). Den præsenterede protokol inkluderer eksperimentel opsætning af systemet, frøsterilisering og spiring af seks plantearter, transplantation af frøplanter til krukker, forskellige vækstmedier, mikrobeinokulation, rodekssudatprøveudtagning og ekssudatbehandling til analyse.
Det eksperimentelle system, der præsenteres her, er baseret på glaskrukker og glasperler og giver således et simpelt, lavt vedligeholdelsesniveau og alsidigt halvhydroponisk system til at studere rodekssudation i forskellige sammenhænge. Det er blevet brugt i undersøgelser, der undersøger ekssudationsprofilerne for forskellige plantearter25, ekssudationens reaktioner på forskellige vækstbetingelser25 samt indflydelsen af jordens fysiokemiske egenskaber på ekssudation22. Systemet er velegnet til alle plantearter, der testes her i længere vækstperioder, der spænder fra uger til måneder. Vedligeholdelsen af sterile forhold er ligetil, ligesom podningen med bakterier, som vedvarer i løbet af den analyserede 2-ugers vækstperiode. Således tillader det eksperimentelle system ikke kun en kontrolleret samling af rodekssudater under sterile forhold, men det kan også bruges til at studere plante-mikrobe-interaktioner. Desuden kan plantevækstmedierne varieres for at studere metaboliske reaktioner på forskellige næringsstofniveauer, og vækstperioder kan justeres ved at tilpasse lysforholdene eller bruge krukker i forskellige størrelser.
Undersøgelse af rodekssudater under hydroponiske eller semihydroponiske forhold forbliver standard i marken, hovedsageligt på grund af den forbedrede opløsning af metabolitter med lav koncentration11. Mange hydroponiske tilgange er afhængige af petriskåle, multibrøndplader eller andre små beholdere, der tillader sterilitet og høj gennemstrømning, men begrænser eksperimentering til små planter eller frøplanter dyrket i miljøer med høj luftfugtighed 17,18,26,27. I den præsenterede glasbeholderopsætning tilvejebringes tilstrækkelig hovedplads af de sammenligneligt store krukker, hvilket tillader forlængede vækstperioder. Micropore tape striber sikker luftudveksling, samtidig med at steriliteten opretholdes. Således kan selv høje monocots som byg og majs dyrkes i glasbeholderopsætningen i flere uger. Små planter som A. thaliana og kløver kan studeres i 4-5 uger efter spiring, herunder vegetative og reproduktive stadier.
Alternative hydroponiske opsætninger er også tilgængelige for større anlæg, men disse kræver ofte specialfremstillede kasser og indløb lavet af mesh, skumplader og engraftmentkurve til plantestøtte 15,28,29,30. Derudover er disse enheder normalt ikke indstillet til at være sterile, eller de kræver udfordrende opsætnings- og vedligeholdelsesprocedurer for at holde dem fri for mikrobielle og / eller kemiske kontamineringer. Opsætning og vedligeholdelse af sterilitet i det præsenterede eksperimentelle system er ligetil. Derudover reducerer brugen af glas til krukker og perler tilstedeværelsen af forurenende stoffer, der udvaskes fra plast, og sparer ressourcer, da det let kan vaskes og genbruges.
Glasperler er tidligere blevet anvendt til at efterligne jordpartikler. De inducerer naturlig rodudvikling i udstyr til prøveudtagning af rodekssudation, såsom ekssudationsfælder31 eller andre semihydroponiske systemer19. Glaskrukkeopsætningen udnytter denne udvikling og introducerer perlerne som koloniseringsoverflade for mikrober. I jord udvikler mikrobiomet omkring planterødder sig i et halvfast miljø med kompakte partikler og rum fyldt med luft eller vand. Selvom glasbeholderopsætningen ikke inkluderer aktiv beluftning af vækstmediet, hvorfor den nedre væskefase sandsynligvis ikke indeholder optimale iltniveauer, skaber kombinationen af et større perlevolumen med et mindre vækstmediumvolumen en fugtig, men luftet øvre fase, hvor mikrober kan vokse under oxiske forhold. Andre har foreslået at ryste vækstbeholdere26,28 eller bruge slanger koblet til luftpumper19,29 for at opretholde lufttilførsel i hydroponiske vækstsystemer. Disse systemer er imidlertid enten indstillet til ikke at være sterile eller kræver specialmateriale og konstant overvågning for at opretholde steriliteten. Derudover er der i tilfælde af omrystning meget omhu for at undgå nedsænkning af skud i vækstopløsninger og beskadigelse af rodsystemer. Ikke desto mindre kunne den præsenterede eksperimentelle opsætning, hvis det ønskes, tilpasses med yderligere materiale til beluftning.
Et afgørende aspekt at overveje i alle plante-mikrobe-interaktionsundersøgelser, der undersøger stofskiftet, er, at mikrober nedbryder planteafledte forbindelser og producerer metabolitter alene. Uden en specialiseret steril eksperimentel opsætning er det ikke muligt at skelne mellem plante- og mikrobeafledte metabolitter. For at hæmme mikrobiel aktivitet og berige planteafledte forbindelser foreslog Oburger et al. at kemisk sterilisere rodekssudatprøvetagningsopløsningen for at hæmme bakteriel nedbrydning32. Effekten af kemiske inhibitorer kunne undersøges i det præsenterede eksperimentelle system, hvor ekssudationsprofiler for sterile versus ikke-sterile planter behandlet med eller uden inhibitoren sammenlignes.
En hovedbegrænsning ved den præsenterede glasbeholderopsætning er, at vækstbetingelserne forbliver meget kunstige sammenlignet med jord. Ekssudater fra jorddyrkede planter indsamles ofte enten fra nedsivningssystemer13, hvor opløsningsmiddelgennemstrømninger samles i bunden af vækstbeholdere, eller jordhydroponiske hybridsystemer, hvor planter oprindeligt dyrkes i jord og derefter overføres til hydroponiske forhold16,33. I modsætning til glasbeholderopsætningen er disse procedurer normalt destruktive og tillader ikke flere samlinger over tid i skiftende vækstmiljøer. Mens der i perkoleringssystemer udtages prøver af jordbaggrunden sammen med ekssudaterne, omgås problemet med høj jordmetabolisk baggrund i jordhydroponiske hybridsystemer med overførsel til hydroponiske forhold til ekssudatopsamling. Selvom restitutionstider er blevet implementeret for at reducere metabolitlækage via sårede rødder11, er planteoverførslen meget forstyrrende, og sår vil sandsynligvis fortsætte, og plantemetabolismen kan ændre sig som reaktion på overførsel til hydroponiske forhold. Desuden fremkaldes et osmotisk chok i mange tilfælde ved at overføre planter til vand i stedet for en passende vækstopløsning16,33. I den præsenterede protokol udveksles vækstopløsningen med en ækvimolær opløsning for at opretholde osmotisk balance, hvilket stadig gør det muligt at fange ekssudation inden for et kort, defineret tidsvindue. Ændringen af vækstopløsningen er almindelig praksis i mange offentliggjorte undersøgelser og kan let opnås i hydroponiske opsætninger uden rodsår 12,16,26,34. På grund af sin alsidighed kan det præsenterede eksperimentelle system let tilpasses til at efterligne mere naturlige forhold, for eksempel ved at anvende sterilt eller ikke-sterilt jordekstrakt som en vækstopløsning med eller uden tilstedeværelse af faste jordpartikler. Den gradvise ændring mod naturlige forhold gør det muligt at studere virkningen af de forskellige fysiokemiske jordegenskaber og mikrobielle tilstedeværelse på plantemetabolisme og fysiologi. Før det videnskabelige samfund har en god forståelse af ekssudation i forskellige miljøer, er det ønskeligt at anvende jordbaserede og hydroponiske systemer parallelt, da begge opsætninger har deres fordele og begrænsninger13.
Afslutningsvis skiller den præsenterede semihydroponiske, glasbaserede eksperimentelle opsætning sig ud på grund af sin enkelhed kombineret med høj alsidighed af applikationer. Det præsenterer en tilgængelig, billig måde at indsamle og studere ekssudation under sterile forhold eller i kombination med mikrober og plante-mikrobe-interaktioner.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Prof. Dr. Nicola Zamboni og Prof. Dr. Uwe Sauer fra ETH Zürich, Schweiz, for at bestemme rodekssudationsprofilerne med direkte injektion og Prof. Dr. Klaus Schläppi fra Basel Universitet for A. thaliana kommensale bakterier. Desuden anerkender vi Swiss National Science Foundation (PR00P3_185831 til JS, der støtter S.M., A.S., E.M.S.) og PSC-Syngenta Fellowship-programmet (tildelt professor Dr. Klaus Schläppi og JS, der støtter C.J.).
Agar powder for bacteriology | VWR | 20767.298 | |
Aluminum foil | FORA GmbH | ||
Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301-1KG | ACS reagent, Eur >- 98% |
Autoclave VX-150 | Systec | 1150 | |
Balance | Sartorius | QUINTIX64-1S | |
Centrifuge | Hermle Labortechnik GmbH | 305.00 V05 | |
Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Difco LB Broth, Lennox | BD | 240210 | |
Ethanol | Reuss-Chemie AG | RC-A15-A-005L | |
Filtered deionized water | Merck Millipore | Milli-Q IQ7000 | |
Glass beads | Carl Roth | HH56.1 | 5 mm |
Hydrochloric acid | Merk | 1.00317.1000 | |
Inoculation loop | Karl Hammacher GmbH | HWO_070-21 | |
Jars | Weck | 105741 | 850 mL |
Lyophilizer | Christ | Alpha 2-4 LSCplus | |
Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 2189.1 | |
Matrix Orbital thermoshaker | IKA | 10006248 | |
Microcentrifuge tube | Sarstedt AG & Co. KG | 72.695.500 | SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP |
Micropore tape | 3M | 1530-0 | 1.25 cm x 9.1 m |
Micropore tape | 3M | 1530-1 | 2.5 cm x 9.1 m |
Murashige & Skoog Medium (MS) | Duchefa Biochemie | M0221.0050 | |
Growth chamber | Percival | SE41-TLCU4 | 16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night |
Phyto agar | Duchefa Biochemie | P1003.1000 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 8.14353.0100 | |
SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | |
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl | Carl Roth | 9062.4 | |
Square petri dish | Greiner Bio-One | 688102 | 120x120x17 mm, with vents |
Stericup Quick release | Millipore | S2GPU05RE | 0.22 µm PES, 500 mL |
Sterile bench | FASTER S.r.l. | FlowFast H 18 |