Tredimensionel akustisk monteringsenhed til massefremstilling af cellesfæroider
Summary
Cellesfæroider er blevet betragtet som en potentiel model inden for biologiske anvendelser. Denne artikel beskriver protokoller til skalerbar generering af cellesfæroider ved hjælp af en 3D-akustisk samlingsenhed, som giver en effektiv metode til robust og hurtig fremstilling af ensartede cellesfæroider.
Abstract
Cellesfæroider er lovende tredimensionelle (3D) modeller, der har fået bred anvendelse på mange biologiske områder. Denne protokol præsenterer en metode til fremstilling af højkvalitets og højkapacitetscellesfæroider ved hjælp af en 3D-akustisk monteringsenhed gennem manøvrerbare procedurer. Den akustiske monteringsanordning består af tre blyzirkonattitanattransducere (PZT), der hver er anbragt i X/Y/Z-planet i et kvadratisk polymethylmethacrylatkammer (PMMA). Denne konfiguration gør det muligt at generere et 3D-dot-array-mønster af leviterede akustiske noder (LAN’er), når der anvendes tre signaler. Som et resultat kan celler i gelatinemethacryloyl (GelMA) -opløsningen drives til LAN’erne og danne ensartede celleaggregater i tre dimensioner. GelMA-løsningen UV-fotohærdes og tværbindes derefter for at fungere som et stillads, der understøtter væksten af celleaggregater. Endelig opnås masser af modne sfæroider og hentes ved efterfølgende at opløse GelMA-stilladserne under milde forhold. Den foreslåede nye 3D-enhed til samling af akustiske celler vil muliggøre opskalering af fremstilling af cellesfæroider og endda organoider, hvilket giver stor potentiel teknologi på det biologiske område.
Introduction
3D in vitro kulturmodeller, som giver mere in vivo-lignende strukturelle og morfologiske egenskaber sammenlignet med konventionelle 2D-kulturmodeller, er blevet anerkendt som lovende systemer i forskellige biomedicinske applikationer såsom vævsteknik, sygdomsmodellering og lægemiddelscreening 1,2,3. Som en type 3D-kulturmodel henviser cellesfæroider typisk til celleaggregering, hvilket skaber 3D-sfæroidale strukturer kendetegnet ved forbedrede celle-celle- og cellematrixinteraktioner 4,5,6. Derfor er fremstilling af cellesfæroider blevet et kraftfuldt værktøj til at muliggøre forskellige biologiske undersøgelser.
Forskellige teknikker, herunder hængende dråbe7, ikke-klæbende plader8 eller mikrobrøndsenheder9, er blevet udviklet til opnåelse af sfæroider. I princippet letter disse metoder almindeligvis cellesamling ved at udnytte fysiske kræfter såsom tyngdekraft, samtidig med at interaktioner mellem celler og substratet minimeres. De involverer dog ofte arbejdskrævende processer, har lav produktivitet og udgør udfordringer for styring af sfærisk størrelse10,11. Det er vigtigt, at produktionen af sfæroider med den ønskede størrelse og ensartethed i tilstrækkelig mængde er af største betydning for at tilfredsstille specifikke biologiske anvendelser. I modsætning til de ovennævnte metoder har akustiske bølger, som en type ekstern kraftdrevet teknik 12,13,14, vist potentiale for massefremstilling af cellesfæroider med høj kvalitet og gennemstrømning baseret på princippet om at forbedre celleaggregering gennem eksterne kræfter 15,16,17,18 . I modsætning til elektromagnetiske eller magnetiske kræfter er akustisk baserede cellemanipulationsteknikker ikke-invasive og etiketfrie, hvilket muliggør sfærisk dannelse med fremragende biokompatibilitet19,20.
Almindeligvis er stående overflade akustiske bølger (SAW’er) og bulk akustiske bølger (BAWs) -baserede enheder blevet udviklet til at generere sfæroider ved hjælp af de akustiske noder (AN’er) produceret af tilsvarende stående akustiske felter 21,22,23. Især akustiske monteringsenheder baseret på BAW’er, med fordelene ved praktisk fremstilling, nem betjening og fremragende skalerbarhed, har fået opmærksomhed til fremstilling af cellesfæroider24,25. Vi har for nylig udviklet en let BAWs-baseret akustisk monteringsenhed med evnen til at generere sfæroider med høj gennemstrømning26. Den foreslåede anordning består af et firkantet polymethylmethacrylatkammer (PMMA) med tre blyzirkonattitanattransducere anbragt henholdsvis i X/Y/Z-planet. Dette arrangement gør det muligt at oprette et 3D-dot-array-mønster af leviterede akustiske noder (LAN’er) til samling af køreceller. Sammenlignet med tidligere rapporterede BAWs- eller SAWs-baserede enheder, som kun kan oprette et 1D- eller 2D-array af AN’er 27,28,29, muliggør den nuværende enhed en 3D-dot-array af LAN’er til hurtig dannelse af celleaggregater i gelatinemethacryloyl (GelMA) opløsningen. Derefter modnes celleaggregater til sfæroider med høj levedygtighed inden for de fotohærdede GelMA-stilladser efter tre dages dyrkning. Endelig blev et stort antal sfæroider med ensartet størrelse let opnået fra GelMA-stilladserne til downstream-applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiv og stabil fremstilling af cellesfæroider med høj gennemstrømning ved hjælp af teknologier som 3D akustisk samlingsenhed har et stort løfte om at fremme biomedicinsk teknik og lægemiddelscreening 1,2,3. Denne tilgang forenkler masseproduktionen af cellesfæroider gennem enkle procedurer.
Der er dog kritiske faktorer, der skal overvejes, når du bruger denne akustiske enhed. Skabelsen af …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) og Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
