Driedimensionaal akoestisch assemblageapparaat voor massaproductie van celsferoïden
Summary
Celsferoïden worden beschouwd als een potentieel model op het gebied van biologische toepassingen. Dit artikel beschrijft protocollen voor het schaalbaar genereren van celsferoïden met behulp van een 3D akoestisch assemblageapparaat, dat een efficiënte methode biedt voor de robuuste en snelle fabricage van uniforme celsferoïden.
Abstract
Celsferoïden zijn veelbelovende driedimensionale (3D) modellen die brede toepassingen hebben gekregen in veel biologische gebieden. Dit protocol presenteert een methode voor het vervaardigen van hoogwaardige celsferoïden met een hoge doorvoer met behulp van een 3D akoestisch assemblageapparaat door middel van manoeuvreerbare procedures. Het akoestische assemblageapparaat bestaat uit drie loodzirkonaattitanaat (PZT)-transducers, elk gerangschikt in het X/Y/Z-vlak van een vierkante polymethylmethacrylaatkamer (PMMA). Deze configuratie maakt het mogelijk om een 3D dot-array-patroon van zwevende akoestische knooppunten (LAN’s) te genereren wanneer drie signalen worden toegepast. Als gevolg hiervan kunnen cellen in de gelatinemethacryloyl (GelMA)-oplossing naar de LAN’s worden gedreven, waardoor uniforme celaggregaten in drie dimensies worden gevormd. De GelMA-oplossing wordt vervolgens UV-gefotocureerd en verknoopt om te dienen als een steiger die de groei van celaggregaten ondersteunt. Ten slotte worden massa’s gerijpte sferoïden verkregen en opgehaald door de GelMA-steigers vervolgens onder milde omstandigheden op te lossen. Het voorgestelde nieuwe 3D-apparaat voor de assemblage van akoestische cellen zal de opschaling van de fabricage van celsferoïden en zelfs organoïden mogelijk maken, wat een groot potentieel biedt voor technologie op biologisch gebied.
Introduction
3D in vitro kweekmodellen, die meer in vivo-achtige structurele en morfologische kenmerken bieden in vergelijking met conventionele 2D-kweekmodellen, zijn erkend als veelbelovende systemen in verschillende biomedische toepassingen zoals weefselmanipulatie, ziektemodellering en screening van geneesmiddelen 1,2,3. Als een type 3D-kweekmodel verwijzen celsferoïden meestal naar celaggregatie, waardoor 3D-sferoïdale structuren ontstaan die worden gekenmerkt door verbeterde cel-cel- en cel-matrixinteracties 4,5,6. Daarom is het fabriceren van celsferoïden een krachtig hulpmiddel geworden om diverse biologische studies mogelijk te maken.
Er zijn verschillende technieken ontwikkeld, waaronder hangende druppel7, niet-klevende platen8 of microtiterapparaten9, om sferoïden te verkrijgen. In principe vergemakkelijken deze methoden gewoonlijk de celassemblage door gebruik te maken van fysieke krachten zoals zwaartekracht, terwijl interacties tussen cellen en het substraat worden geminimaliseerd. Ze hebben echter vaak betrekking op arbeidsintensieve processen, hebben een lage productiviteit en vormen een uitdaging voor het beheersen van de sferoïde grootte10,11. Belangrijk is dat de productie van sferoïden met de gewenste grootte en uniformiteit in voldoende hoeveelheid van het grootste belang is om aan specifieke biologische toepassingen te voldoen. In tegenstelling tot de bovengenoemde methoden hebben akoestische golven, als een type externe-kracht-aangedreven techniek 12,13,14, potentieel getoond voor massaproductie van celsferoïden met hoge kwaliteit en doorvoer, gebaseerd op het principe van het verbeteren van celaggregatie door externe krachten 15,16,17,18. In tegenstelling tot elektromagnetische of magnetische krachten zijn op akoestiek gebaseerde celmanipulatietechnieken niet-invasief en labelvrij, waardoor sferoïde vorming met uitstekende biocompatibiliteit mogelijk is19,20.
Gewoonlijk zijn op staande oppervlaktegolven (SAW’s) en op bulk akoestische golven (BAW’s) gebaseerde apparaten ontwikkeld om sferoïden te genereren, gebruikmakend van de akoestische knooppunten (AN’s) die worden geproduceerd door overeenkomstige staande akoestische velden 21,22,23. Met name akoestische assemblageapparaten op basis van BAW’s, met de verdiensten van gemakkelijke fabricage, eenvoudige bediening en uitstekende schaalbaarheid, hebben aandacht gekregen voor het vervaardigen van celsferoïden 24,25. We hebben onlangs een eenvoudig akoestisch assemblageapparaat op basis van BAW’s ontwikkeld met de mogelijkheid om sferoïden te genereren met een hoge doorvoer26. Het voorgestelde apparaat bestaat uit een vierkante polymethylmethacrylaat (PMMA)-kamer met drie loodzirkonaattitanaat (PZT)-transducers die respectievelijk in het X/Y/Z-vlak zijn gerangschikt. Deze opstelling maakt het mogelijk om een 3D-dot-array-patroon van zwevende akoestische knooppunten (LAN’s) te creëren voor het aansturen van celassemblage. Vergeleken met eerder gerapporteerde BAW’s- of SAW’s-gebaseerde apparaten, die alleen een 1D- of 2D-array van AN’s 27,28,29 kunnen maken, maakt het huidige apparaat een 3D-dot-array van LAN’s mogelijk voor snelle vorming van celaggregaat in de gelatinemethacryloyl (GelMA)-oplossing. Vervolgens rijpten celaggregaten na drie dagen cultivatie tot sferoïden met een hoge levensvatbaarheid in de gefotocureerde GelMA-steigers. Ten slotte kon een groot aantal sferoïden met uniforme grootte gemakkelijk worden verkregen uit de GelMA-steigers voor stroomafwaartse toepassingen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Efficiënte en stabiele fabricage van celsferoïden met een hoge doorvoer met behulp van technologieën zoals het 3D akoestische assemblageapparaat is veelbelovend voor het bevorderen van biomedische technologie en het screenen van geneesmiddelen 1,2,3. Deze aanpak vereenvoudigt de massaproductie van celsferoïden door middel van eenvoudige procedures.
Er zijn echter kritische factoren waarmee u reken…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (2022YFA1104600) en de Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
