細胞スフェロイドの量産のための3次元音響組立装置
Summary
細胞スフェロイドは、生物学的応用の分野における1つの潜在的なモデルと見なされてきました。本稿では、均一な細胞スフェロイドを頑健かつ迅速に作製するための効率的な方法を提供する3D音響アセンブリデバイスを使用して細胞スフェロイドをスケーラブルに生成するためのプロトコルについて説明します。
Abstract
細胞スフェロイドは、多くの生物学的分野で幅広い用途を獲得している有望な3次元(3D)モデルです。このプロトコルは、3D音響アセンブリデバイスを使用して、操作可能な手順で高品質でハイスループットな細胞スフェロイドを製造する方法を提示します。音響アセンブリデバイスは、3つのチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサで構成され、それぞれが正方形のポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバーのX/Y/Z平面に配置されています。この構成により、3つの信号が印加されたときに浮上音響ノード(LAN)の3Dドットアレイパターンを生成することができます。その結果、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)溶液中の細胞をLANに駆動し、3次元で均一な細胞凝集体を形成することができます。次に、GelMA溶液をUV光硬化および架橋して、細胞凝集体の増殖をサポートする足場として機能します。最後に、成熟したスフェロイドの塊が得られ、続いて穏やかな条件下でGelMAスキャフォールドを溶解することによって回収されます。提案された新しい3D音響細胞アセンブリデバイスは、細胞スフェロイド、さらにはオルガノイドのスケールアップ製造を可能にし、生物学分野で大きな可能性を秘めた技術を提供します。
Introduction
従来の2D培養モデルと比較して、よりin vivoのような構造的および形態学的特性を提供する3Din vitro培養モデルは、組織工学、疾患モデリング、薬物スクリーニングなどのさまざまな生物医学的アプリケーションにおいて有望なシステムとして認識されています1,2,3.3D培養モデルの1つのタイプとして、細胞スフェロイドは通常、細胞凝集を指し、細胞間および細胞マトリックスの相互作用の強化を特徴とする3Dスフェロイド構造を作成します4,5,6。そのため、細胞スフェロイドの作製は、多様な生物学的研究を可能にする強力なツールとなっています。
スフェロイドを得るために、吊り下げ液7、非粘着プレート8、またはマイクロウェル装置9を含む様々な技術が開発されている。原理的には、これらの方法は、細胞と基質の間の相互作用を最小限に抑えながら、重力などの物理的な力を利用することで、細胞の組み立てを容易にするのが一般的です。しかし、多くの場合、労働集約的なプロセスが必要であり、生産性が低く、回転楕円体サイズ10,11を制御するための課題があります。重要なことは、所望のサイズと均一性を十分な量で得るスフェロイドを製造することが、特定の生物学的用途を満たすために最も重要であるということです。上記の方法とは対照的に、音波は、外力駆動技術12,13,14の一種として、外力15,16,17,18によって細胞凝集を促進する原理に基づいて、高品質でスループットの高い細胞スフェロイドの大量生産の可能性を示しています15,16,17,18.電磁力や磁力とは異なり、音響ベースの細胞操作技術は非侵襲的でラベルフリーであり、優れた生体適合性を備えたスフェロイド形成を可能にします19,20。
一般に、定在弾性表面波(SAW)およびバルク弾性波(BAW)ベースのデバイスは、対応する定在音場21、22、23によって生成される音響ノード(AN)を利用して、回転楕円体を生成するために開発されてきました。特に、BAWをベースとした音響組立装置は、製造の簡便性、操作の容易さ、拡張性に優れるというメリットから、細胞スフェロイドの作製に注目されている24,25。我々は最近、ハイスループットでスフェロイドを生成する能力を持つ簡便なBAWsベースの音響アセンブリデバイスを開発しました26。提案されたデバイスは、X/Y/Z平面にそれぞれ配置された3つのチタン酸ジルコン酸鉛(PZT)トランスデューサを備えた正方形のポリメチルメタクリレート(PMMA)チャンバーで構成されています。この配置により、セルアセンブリを駆動するための浮上音響ノード(LAN)の3Dドットアレイパターンを作成できます。AN27,28,29の1Dまたは2Dアレイしか作成できない、以前に報告されたBAWまたはSAWベースのデバイスと比較して、本デバイスは、ゼラチンメタクリロイル(GelMA)溶液内での迅速な細胞凝集体形成のためのLANの3Dドットアレイを可能にします。その後、細胞凝集体は、3日間の培養後、光硬化したGelMAスキャフォールド内で生存率の高いスフェロイドに成熟しました。最後に、下流アプリケーション用のGelMAスキャフォールドから、均一なサイズの多数のスフェロイドが簡単に得られました。
Protocol
Representative Results
Discussion
3D音響アセンブリデバイスなどの技術を使用して、ハイスループットで細胞スフェロイドを効率的かつ安定的に作製することは、生物医学工学と薬物スクリーニングの進歩に大きな期待を寄せています1,2,3。このアプローチにより、簡単な手順で細胞スフェロイドの大量生産が簡素化されます。
ただし…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
TISの研究は、中国の国家重点研究開発プログラム(2022YFA1104600)と中国浙江省自然科学基金会(LQ23H160011)の支援を受けました。
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
