Трехмерное акустическое сборочное устройство для массового производства клеточных сфероидов
Summary
Клеточные сфероиды рассматривались как одна из потенциальных моделей в области биологических приложений. В данной статье описываются протоколы для масштабируемой генерации клеточных сфероидов с использованием 3D-акустического сборочного устройства, которое обеспечивает эффективный метод надежного и быстрого изготовления однородных клеточных сфероидов.
Abstract
Клеточные сфероиды являются перспективными трехмерными (3D) моделями, получившими широкое применение во многих областях биологии. В этом протоколе представлен метод изготовления высококачественных и высокопроизводительных клеточных сфероидов с использованием устройства 3D-акустической сборки с помощью маневренных процедур. Устройство акустической сборки состоит из трех преобразователей из титаната цирконата свинца (PZT), каждый из которых расположен в плоскости X/Y/Z квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА). Эта конфигурация позволяет генерировать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) при подаче трех сигналов. В результате ячейки в растворе желатина метакрилоила (GelMA) могут быть перемещены в ЛВС, образуя однородные клеточные агрегаты в трех измерениях. Затем раствор GelMA подвергается УФ-фотоотверждению и сшивается в качестве каркаса, поддерживающего рост клеточных агрегатов. Наконец, массы зрелых сфероидов получают и извлекают путем последующего растворения скаффолдов GelMA в мягких условиях. Предлагаемое новое 3D-устройство для сборки акустических клеток позволит масштабировать производство клеточных сфероидов и даже органоидов, предлагая большой потенциал технологии в биологической области.
Introduction
3D-модели культивирования in vitro, которые обеспечивают больше структурных и морфологических характеристик in vivo по сравнению с обычными 2D-моделями культивирования, были признаны перспективными системами в различных биомедицинских приложениях, таких как тканевая инженерия, моделирование заболеваний и скрининг лекарств 1,2,3. Как один из типов 3D-модели культуры, клеточные сфероиды обычно относятся к клеточной агрегации, создавая трехмерные сфероидальные структуры, характеризующиеся усиленными межклеточными и межклеточными и межклеточными матриксными взаимодействиями 4,5,6. Таким образом, изготовление клеточных сфероидов стало мощным инструментом для проведения разнообразных биологических исследований.
Для получения сфероидов были разработаны различные методы, в том числе подвесная капля7, неадгезивные пластины8 или устройства9 с микролунками. В принципе, эти методы обычно облегчают сборку клеток, используя физические силы, такие как гравитационная сила, при этом сводя к минимуму взаимодействия между клетками и субстратом. Однако они часто связаны с трудоемкими процессами, имеют низкую производительность и создают проблемы для управления размером сфероида 10,11. Важно отметить, что производство сфероидов желаемого размера и однородности в достаточном количестве имеет первостепенное значение для удовлетворения конкретных биологических задач. В отличие от вышеупомянутых методов, акустические волны, как один из видов техники, управляемой внешней силой 12,13,14, показали потенциал для массового производства клеточных сфероидов с высоким качеством и пропускной способностью, основанных на принципе усиления агрегации клеток за счет внешних сил 15,16,17,18. В отличие от электромагнитных или магнитных сил, акустические методы манипулирования клетками являются неинвазивными и не требуют меток, что позволяет формировать сфероиды с отличной биосовместимостью19,20.
Как правило, для генерации сфероидов разрабатываются устройства, основанные на акустических волнах стоячей поверхности (ПАВ) и объемных акустических волнах (БАВ), с использованием акустических узлов (АН), создаваемых соответствующими стоячими акустическими полями 21,22,23. В частности, акустические сборочные устройства на основе БАВ, обладающие такими достоинствами, как удобство изготовления, простота эксплуатации и отличная масштабируемость, привлекли внимание изготовлением сфероидов ячеек24,25. Недавно мы разработали легкое акустическое сборочное устройство на основе BAWs, способное генерировать сфероиды с высокой пропускной способностью26. Предлагаемое устройство состоит из квадратной камеры из полиметилметакрилата (ПММА) с тремя преобразователями цирконат-титаната (ПЗТ), расположенными соответственно в плоскости X/Y/Z. Такая компоновка позволяет создавать 3D-точечную матрицу левитирующих акустических узлов (ЛВС) для сборки ячеек. По сравнению с ранее описанными устройствами на основе BAW или SAW, которые могут создавать только 1D или 2D массив ANs 27,28,29, настоящее устройство позволяет создавать 3D точечный массив локальных сетей для быстрого образования клеточных агрегатов в растворе желатина метакрилоила (GelMA). Впоследствии клеточные агрегаты созревали в сфероиды с высокой жизнеспособностью в фотоотвержденных скаффолдах GelMA после трех дней культивирования. Наконец, большое количество сфероидов одинакового размера было легко получено из скаффолдов GelMA для последующих применений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эффективное и стабильное изготовление клеточных сфероидов с высокой пропускной способностью с использованием таких технологий, как устройство 3D-акустической сборки, имеет большие перспективы для развития биомедицинской инженерии и скрининга лекарств 1,2,3<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2022YFA1104600) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян Китая (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
