Tredimensionell akustisk monteringsanordning för masstillverkning av cellsfäroider
Summary
Cellsfäroider har ansetts vara en potentiell modell inom biologiska tillämpningar. Den här artikeln beskriver protokoll för skalbar generering av cellsfäroider med hjälp av en akustisk 3D-monteringsenhet, vilket ger en effektiv metod för robust och snabb tillverkning av enhetliga cellsfäroider.
Abstract
Cellsfäroider är lovande tredimensionella (3D) modeller som har fått breda tillämpningar inom många biologiska områden. Detta protokoll presenterar en metod för tillverkning av högkvalitativa och höggenomförda cellsfäroider med hjälp av en 3D-akustisk monteringsanordning genom manövrerbara procedurer. Den akustiska monteringsanordningen består av tre blyzirkonattitanatgivare (PZT), var och en anordnad i X/Y/Z-planet i en fyrkantig kammare av polymetylmetakrylat (PMMA). Denna konfiguration möjliggör generering av ett 3D-punktmatrismönster av leviterade akustiska noder (LAN) när tre signaler appliceras. Som ett resultat kan celler i gelatinmetakryloyllösningen (GelMA) drivas till LAN och bilda enhetliga cellaggregat i tre dimensioner. GelMA-lösningen UV-fotohärdas sedan och tvärbinds för att fungera som en byggnadsställning som stöder tillväxten av cellaggregat. Slutligen erhålls massor av mogna sfäroider och hämtas genom att därefter lösa upp GelMA-ställningarna under milda förhållanden. Den föreslagna nya 3D-enheten för akustisk cellmontering kommer att möjliggöra uppskalning av tillverkning av cellsfäroider och till och med organoider, vilket erbjuder stor potential för teknik inom det biologiska området.
Introduction
3D de vitro-odlingsmodeller, som ger mer in vivo-liknande strukturella och morfologiska egenskaper jämfört med konventionella 2D-odlingsmodeller, har erkänts som lovande system i olika biomedicinska tillämpningar såsom vävnadsteknik, sjukdomsmodellering och läkemedelsscreening 1,2,3. Som en typ av 3D-odlingsmodell hänvisar cellsfäroider vanligtvis till cellaggregering, vilket skapar 3D-sfäroidala strukturer som kännetecknas av förbättrade cell-cell- och cell-matrisinteraktioner 4,5,6. Därför har tillverkning av cellsfäroider blivit ett kraftfullt verktyg för att möjliggöra olika biologiska studier.
Olika tekniker, inklusive hängande droppe7, icke-vidhäftande plattor8 eller mikrobrunnsanordningar9, har utvecklats för att erhålla sfäroider. I princip underlättar dessa metoder vanligtvis cellmontering genom att utnyttja fysiska krafter som gravitationskraft samtidigt som interaktioner mellan celler och substratet minimeras. De involverar dock ofta arbetsintensiva processer, har låg produktivitet och utgör utmaningar för att kontrollera sfäroidstorlek10,11. Det är viktigt att produktionen av sfäroider med önskad storlek och enhetlighet i tillräcklig mängd är av yttersta vikt för att tillgodose specifika biologiska tillämpningar. Till skillnad från de ovan nämnda metoderna har akustiska vågor, som en typ av extern kraftdriven teknik 12,13,14, visat potential för masstillverkning av cellsfäroider med hög kvalitet och genomströmning, baserat på principen att förbättra cellaggregering genom yttre krafter 15,16,17,18. Till skillnad från elektromagnetiska eller magnetiska krafter är akustiskt baserade cellmanipulationstekniker icke-invasiva och märkningsfria, vilket möjliggör sfäroidbildning med utmärkt biokompatibilitet19,20.
Vanligtvis har akustiska vågor på stående yta (SAW) och akustiska bulkvågor (BAW) -baserade enheter utvecklats för att generera sfäroider, med hjälp av de akustiska noderna (AN) som produceras av motsvarande stående akustiska fält 21,22,23. Speciellt akustiska monteringsanordningar baserade på BAWs, med fördelarna med bekväm tillverkning, enkel användning och utmärkt skalbarhet, har fått uppmärksamhet för tillverkning av cellsfäroider24,25. Vi har nyligen utvecklat en enkel BAWs-baserad akustisk monteringsenhet med förmågan att generera sfäroider med hög genomströmning26. Den föreslagna anordningen består av en fyrkantig polymetylmetakrylatkammare (PMMA) med tre blyzirkonattitanatgivare (PZT) anordnade i X/Y/Z-planet. Detta arrangemang gör det möjligt att skapa ett 3D-punktmatrismönster av leviterade akustiska noder (LAN) för att driva cellmontering. Jämfört med tidigare rapporterade BAWs- eller SAWs-baserade enheter, som bara kan skapa en 1D- eller 2D-array av ANs 27,28,29, möjliggör den nuvarande enheten en 3D-punktmatris av LAN för snabb cellaggregatbildning i gelatinmetakryloyllösningen (GelMA). Därefter mognade cellaggregaten till sfäroider med hög livskraft i de fotohärdade GelMA-ställningarna efter tre dagars odling. Slutligen var det lätt att få ett stort antal sfäroider med enhetlig storlek från GelMA-ställningarna för nedströmsapplikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Effektiv och stabil tillverkning av cellsfäroider med hög genomströmning med hjälp av teknik som 3D-akustisk monteringsenhet är mycket lovande för att främja biomedicinsk teknik och läkemedelsscreening 1,2,3. Detta tillvägagångssätt förenklar massproduktionen av cellsfäroider genom enkla procedurer.
Det finns dock kritiska faktorer att tänka på när du använder denna akustiska enhet. S…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av Kinas nationella nyckelforsknings- och utvecklingsprogram (2022YFA1104600) och Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
References
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).
- Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
- Habanjar, O., Diab-Assaf, M., Caldefie-Chezet, F., Delort, L. 3D cell culture systems: tumor application, advantages, and disadvantages. International Journal of Molecular Sciences. 22 (22), 12200 (2021).
- Decarli, M. C., et al. Cell spheroids as a versatile research platform: formation mechanisms, high throughput production, characterization and applications. Biofabrication. 13 (3), 032002 (2021).
- Lee, Y. B., et al. Engineering spheroids potentiating cell-cell and cell-ECM interactions by self-assembly of stem cell microlayer. Biomaterials. 165, 105-120 (2018).
- Zhuang, P., Chiang, Y. H., Fernanda, M. S., He, M. Using spheroids as building blocks towards 3d bioprinting of tumor microenvironment. International Journal of Bioprinting. 7 (4), 444 (2021).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. 51, e2720 (2011).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Life is 3D: boosting spheroid function for tissue engineering. Trends in Biotechnology. 35 (2), 133-144 (2017).
- Fu, W., et al. Combinatorial drug screening based on massive 3d tumor cultures using micropatterned array chips. Analytical Chemistry. 95 (4), 2504-2512 (2023).
- Kang, S. M., Kim, D., Lee, J. H., Takayama, S., Park, J. Y. Engineered microsystems for spheroid and organoid studies. Advanced Healthcare Materials. 10 (2), 2001284 (2021).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering multi-cellular spheroids for tissue engineering and regenerative medicine. Advanced Healthcare Materials. 9 (23), 2000608 (2020).
- Yang, Y., et al. 3D acoustic manipulation of living cells and organisms based On 2D array. IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 69 (7), 2342-2352 (2022).
- Armstrong, J. P. K., et al. Engineering anisotropic muscle tissue using acoustic cell patterning. Advanced Materials. 30 (43), 1802649 (2018).
- Drinkwater, B. W. A perspective on acoustical tweezers-devices, forces, and biomedical applications. Applied Physics Letters. 117 (18), 180501 (2020).
- Bouyer, C., et al. A Bio-Acoustic Levitational (BAL) assembly method for engineering of multilayered, 3d brain-like constructs, using human embryonic stem cell derived neuro-progenitors. Advanced Materials. 28 (1), 161-167 (2016).
- Chansoria, P., Narayanan, L. K., Schuchard, K., Shirwaiker, R. Ultrasound-assisted biofabrication and bioprinting of preferentially aligned three-dimensional cellular constructs. Biofabrication. 11 (3), 035015 (2019).
- Wu, Y., et al. Acoustic assembly of cell spheroids in disposable capillaries. Nanotechnology. 29 (50), 504006 (2018).
- Hu, X., et al. On-chip hydrogel arrays individually encapsulating acoustic formed multicellular aggregates for high throughput drug testing. Lab on a Chip. 20 (12), 2228-2236 (2020).
- Wu, Z., et al. The acoustofluidic focusing and separation of rare tumor cells using transparent lithium niobate transducers. Lab on a Chip. 19 (23), 3922-3930 (2019).
- Chen, B., et al. High-throughput acoustofluidic fabrication of tumor spheroids. Lab on a Chip. 19 (10), 1755-1763 (2019).
- Sriphutkiat, Y., Kasetsirikul, S., Zhou, Y. Formation of cell spheroids using Standing Surface Acoustic Wave (SSAW). International Journal of Bioprinting. 4 (1), 130 (2018).
- Guex, A. G., Di Marzio, N., Eglin, D., Alini, M., Serra, T. The waves that make the pattern: a review on acoustic manipulation in biomedical research. Materials Today Bio. 10, 100110 (2021).
- Harley, W. S., et al. Advances in biofabrication techniques towards functional bioprinted heterogeneous engineered tissues: A comprehensive review. Bioprinting. 23, 00147 (2021).
- Yang, Y., Dejous, C., Hallil, H. Trends and applications of surface and bulk acoustic wave devices: a review. Micromachines (Basel). 14 (1), 43 (2022).
- Ma, Z., et al. Acoustic holographic cell patterning in a biocompatible hydrogel). Advanced Materials. 32 (4), 1904181 (2020).
- Miao, T. K., et al. High-throughput fabrication of cell spheroids with 3D acoustic assembly devices. International Journal of Bioprinting. 9 (4), 733 (2023).
- Jeger-Madiot, N., et al. Self-organization and culture of Mesenchymal Stem Cell spheroids in acoustic levitation. Scientific Reports. 11 (1), 8355 (2021).
- Cai, H., et al. Acoustofluidic assembly of 3D neurospheroids to model Alzheimer’s disease. Analyst. 145 (19), 6243-6253 (2020).
- Mei, J., Zhang, N., Friend, J. Fabrication of surface acoustic wave devices on lithium niobate. Jove-Journal of Visualized Experiments. (160), e61013 (2020).
- Niculescu, A. G., Chircov, C., Bîrcă, A. C., Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: a review. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 2011 (2011).
