Dispositivo de montaje acústico tridimensional para la fabricación en masa de esferoides celulares
Summary
Los esferoides celulares se han considerado un modelo potencial en el campo de las aplicaciones biológicas. Este artículo describe los protocolos para la generación escalable de esferoides celulares utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D, que proporciona un método eficiente para la fabricación robusta y rápida de esferoides celulares uniformes.
Abstract
Los esferoides celulares son modelos tridimensionales (3D) prometedores que han adquirido amplias aplicaciones en muchos campos biológicos. Este protocolo presenta un método para fabricar esferoides celulares de alta calidad y alto rendimiento utilizando un dispositivo de ensamblaje acústico 3D a través de procedimientos maniobrables. El dispositivo de montaje acústico consta de tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT), cada uno dispuesto en el plano X/Y/Z de una cámara cuadrada de polimetacrilato de metilo (PMMA). Esta configuración permite la generación de un patrón de matriz de puntos 3D de nodos acústicos levitados (LAN) cuando se aplican tres señales. Como resultado, las células de la solución de gelatina de metacriloilo (GelMA) pueden ser conducidas a las LAN, formando agregados celulares uniformes en tres dimensiones. A continuación, la solución GelMA se fotocura con UV y se reticula para que sirva como andamio que soporta el crecimiento de los agregados celulares. Finalmente, se obtienen masas de esferoides maduros y se recuperan disolviendo posteriormente los andamios GelMA en condiciones suaves. El nuevo dispositivo de ensamblaje de células acústicas 3D propuesto permitirá la fabricación a escala de esferoides celulares, e incluso organoides, ofreciendo una tecnología de gran potencial en el campo biológico.
Introduction
Los modelos de cultivo in vitro en 3D, que proporcionan características estructurales y morfológicas más similares a las de in vivo en comparación con los modelos de cultivo 2D convencionales, han sido reconocidos como sistemas prometedores en diversas aplicaciones biomédicas, como la ingeniería de tejidos, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos 1,2,3. Como un tipo de modelo de cultivo 3D, los esferoides celulares suelen referirse a la agregación celular, creando estructuras esferoidales 3D caracterizadas por interacciones mejoradas célula-célula y célula-matriz 4,5,6. Por lo tanto, la fabricación de esferoides celulares se ha convertido en una poderosa herramienta para permitir diversos estudios biológicos.
Para obtener esferoides se han desarrollado diversas técnicas, como la gota colgante7, las placas no adhesivas8 o los dispositivos de micropocillos9. En principio, estos métodos suelen facilitar el ensamblaje celular mediante la utilización de fuerzas físicas como la fuerza gravitacional, al tiempo que minimizan las interacciones entre las células y el sustrato. Sin embargo, a menudo implican procesos que requieren mucha mano de obra, tienen baja productividad y plantean desafíos para controlar el tamaño del esferoide10,11. Es importante destacar que la producción de esferoides con el tamaño y la uniformidad deseados en cantidad suficiente es de suma importancia para satisfacer aplicaciones biológicas específicas. A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, las ondas acústicas, como un tipo de técnica impulsada por fuerzas externas 12,13,14, han mostrado potencial para la fabricación masiva de esferoides celulares con alta calidad y rendimiento, basados en el principio de mejorar la agregación celular a través de fuerzas externas 15,16,17,18 . A diferencia de las fuerzas electromagnéticas o magnéticas, las técnicas de manipulación celular basadas en la acústica no son invasivas y no contienen marcadores, lo que permite la formación de esferoides con una excelente biocompatibilidad19,20.
Comúnmente, se han desarrollado dispositivos basados en ondas acústicas de superficie estacionaria (SAW) y ondas acústicas masivas (BAW) para generar esferoides, utilizando los nodos acústicos (AN) producidos por los campos acústicos permanentes correspondientes 21,22,23. En particular, los dispositivos de ensamblaje acústico basados en BAW, con las ventajas de una fabricación conveniente, fácil operación y excelente escalabilidad, han ganado atención para la fabricación de esferoides celulares24,25. Recientemente hemos desarrollado un dispositivo de ensamblaje acústico fácil basado en BAWs con la capacidad de generar esferoides con alto rendimiento26. El dispositivo propuesto consiste en una cámara cuadrada de polimetacrilato de metilo (PMMA) con tres transductores de titanato de circonato de plomo (PZT) dispuestos respectivamente en el plano X/Y/Z. Esta disposición permite la creación de un patrón de matriz de puntos 3D de nodos acústicos levitados (LAN) para el ensamblaje de celdas de conducción. En comparación con los dispositivos basados en BAW o SAW informados anteriormente, que solo pueden crear una matriz 1D o 2D de ANs 27,28,29, el dispositivo actual permite una matriz de puntos 3D de LAN para la rápida formación de agregados celulares dentro de la solución de gelatina de metacriloilo (GelMA). Posteriormente, los agregados celulares maduraron en esferoides con alta viabilidad dentro de los andamios fotocurados GelMA después de tres días de cultivo. Por último, se obtuvo fácilmente un gran número de esferoides de tamaño uniforme a partir de los andamios GelMA para aplicaciones posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
La fabricación eficiente y estable de esferoides celulares con alto rendimiento utilizando tecnologías como el dispositivo de ensamblaje acústico 3D es muy prometedora para el avance de la ingeniería biomédica y el cribado de fármacos 1,2,3. Este enfoque simplifica la producción masiva de esferoides celulares a través de procedimientos sencillos.
Sin embargo, hay factores críticos a tener en …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2022YFA1104600) y la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Zhejiang de China (LQ23H160011).
Materials
| 0.22-μm filter | Merck | SLGSM33SS | Used for GelMA solution sterilization |
| 35 mm-cell culture dish | Corning | 430165 | Used for culturing cells |
| Confocal microscope | Nikon | A1RHD25 | Fluorescent cell observation |
| DiO dye | Beyotime | C1038 | Dye used to stain cells |
| DMEM | Gibco | 12430054 | Cell culture media |
| FBS | Gibco | 10099141C | Cell culture media supplement |
| Function generator | Rigol | DG5352 | For RF signal generation |
| GelMA | Regenovo | none | Used to prepare bioink |
| GelMA lysis buffer | EFL | EFL-GM-LS-001 | Used to dissolve GelMA scaffolds |
| Inverted microscope | Nikon | Ti-U | Cell observation |
| LAP | Sigma-Aldrich | 900889 | Used as photoinitiator |
| Live-Dead kit | Beyotime | C2015M | Cell vability analysis |
| PBS | Gibco | 10010002 | Used as buffer |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15070063 | Prevent cell culture contamination |
| Power amplifer | Minicircuit | LCY-22+ | Increase the voltage amplitude of the RF signal |
| PZT transducers | Yantai Xingzhiwen Trading Co.,Ltd. | PZT-41 | Functional units for acoustic assembly device |
| T25 cell culture flask | Corning | 430639 | Used for culturing cells |
| Trypan blue | Gibco | 15250061 | Cell counting |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25200056 | Cell dissociation enzyme |
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