Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.
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Article de méthode
Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La visualisation des protéines dans les cellules vivantes à l’aide de la GFP (Green Fluorescent Protein) et d’autres marqueurs fluorescents a considérablement amélioré la compréhension de la localisation, de la dynamique et de la fonction des protéines. Par rapport à l’immunofluorescence, l’imagerie en direct reflète plus précisément la localisation des protéines sans artefacts potentiels résultant de la fixation tissulaire. Il est important de noter que l’imagerie en direct permet une caractérisation quantitative et temporelle des niveaux et de la localisation des protéines, ce qui est crucial pour comprendre les processus biologiques dynamiques tels que le mouvement ou la division cellulaire. Cependant, une limitation majeure des approches de marquage fluorescent est la nécessité d’avoir des niveaux d’expression protéique suffisamment élevés pour obtenir une visualisation réussie. Par conséquent, de nombreuses protéines fluorescentes marquées de manière endogène avec des niveaux d’expression relativement faibles ne peuvent pas être détectées. D’autre part, l’expression ectopique à l’aide de promoteurs viraux peut parfois conduire à une mauvaise localisation des protéines ou à des altérations fonctionnelles dans des contextes physiologiques. Pour remédier à ces limitations, une approche est présentée qui utilise la détection de protéines médiées par des anticorps hautement sensibles dans des embryons vivants, effectuant essentiellement une immunofluorescence sans avoir besoin de fixation tissulaire. Comme preuve de principe, le récepteur Notch marqué à la GFP de manière endogène, qui est à peine détectable dans les embryons vivants, peut être visualisé avec succès après l’injection d’anticorps. De plus, cette approche a été adaptée pour visualiser les modifications post-traductionnelles (PTM) dans les embryons vivants, permettant de détecter les changements temporels dans les schémas de phosphorylation de la tyrosine au cours de l’embryogenèse précoce et révélant une nouvelle sous-population de phosphotyrosine (p-Tyr) sous les membranes apicales. Cette approche peut être modifiée pour s’adapter à d’autres anticorps spécifiques à une protéine, à un marqueur ou à un PTM et devrait être compatible avec d’autres organismes modèles ou lignées cellulaires susceptibles d’être injectés. Ce protocole ouvre de nouvelles possibilités pour l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou PTM qui étaient auparavant difficiles à détecter à l’aide des méthodes traditionnelles de marquage par fluorescence.
Introduction
L’immunofluorescence est une technique fondamentale de la biologie cellulaire moderne développée à l’origine par Albert Coons, qui permet de détecter des molécules dans leurs compartiments cellulaires natifs et de caractériser les compositions moléculaires d’organites ou de machineries subcellulaires1. Couplée à des manipulations génétiques, l’immunofluorescence permet d’établir le concept désormais bien accepté selon lequel la localisation des protéines est essentielle à leur fonction2. Outre les anticorps primaires spécifiques et les colorants fluorescents brillants, le succès de cette technique repose sur un processus....
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Protocole
Les expériences ont été menées conformément aux directives et à l’approbation de l’École des sciences de la vie de l’Université SUSTech. L’organisme utilisé est Drosophila melanogaster, et les génotypes sont Notch-Knockin-GFP (chromosome X) et Sqh-sqh-GFP (chromosome II), généreusement fournis par les laboratoires du Dr François Schweisguth (Institut Pasteur) et du Dr Jennifer Zallen (Institut Sloan Kettering), respectivement. Bien que ce protocole se concentre principalement sur les aspects du marquage des anticorps et de l’imagerie en direct, veuillez vous référer aux rapports publiés pour des descriptions plus détaillées de la collecte et de l’injection d’....
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Résultats
Pour démontrer les avantages de la méthode d’injection d’anticorps par rapport à l’imagerie en direct ou à l’immunofluorescence à base de marqueurs fluorescents, deux études de cas sont fournies qui caractérisent la localisation dynamique d’un récepteur transmembranaire de faible abondance, Notch, et un type de modification post-traductionnelle appelée phosphorylation de la tyrosine dans des embryons vivants.
L’activité de signalisation de l’encoche joue un rôle majeur dans la détermination du.......
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Discussion
Cette procédure présente la méthode spécialisée de marquage par fluorescence avec des anticorps personnalisés et l’injection subséquente dans des embryons de drosophile à un stade précoce. Cette technique facilite la visualisation en temps réel des protéines ou des modifications post-traductionnelles qui existent en faibles quantités et qui sont généralement difficiles à observer par les méthodes conventionnelles de marquage GFP/mCherry.
Il faut faire preuve de prudence lors de l’exte.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous tenons à remercier la Dre Jennifer A. Zallen d’avoir fourni la lignée de drosophile Sqh-GFP et son soutien pour le développement initial de cette technique, ainsi que le Dr François Schweisguth d’avoir fourni la lignée de drosophile Notch-GFP. Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32270809) à H.H.Yu, un généreux soutien financier et personnel de l’École des sciences de la vie, SUSTech, et un financement à Y. Yan de la Commission de l’innovation scientifique et technologique de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agarose | Sangon Biotech | ; A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Kit d’étiquetage d’anticorps | Invitrogen ; | A20185 | La colonne de purification de l’étape 1.6 est incluse dans ce kit |
| Microscope biologique | SOPTOP | EX20 | Lentille oculaire : PL 10X/20. Objectif : 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® ; | ||
| Capillaires en verre borosilicaté | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifugeuse | Eppendorf | 5245 | |
| Filtre à cellules | FALCON | 352350 | |
| Chambre de dessiccation ; | SERRURE& Microscope | HSM8200 | 320ml |
| Mshot | MZ62 | Lentille de l’oculaire : WF10X/22mm. | |
| Ruban adhésif double face | Scotch | 665 | |
| Fine Super pince à épiler | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand&trade ; Lunettes de couverture : Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand&trade ; Superfrost&commerce ; Plus Lames de microscope | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Pince | VETUS | 33A-SA | |
| Huile d’halocarbure 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Huile d’halocarbure 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | La colle Heptane est faite de ruban adhésif double face immergé dans de l’heptane |
| Réactif de déshydratation ; | TOKAI | 1-7315-01 | Remplir à 90 % du volume de la chambre de dessiccation |
| Micromanipulateur manuel | World Precision Instruments | M3301R | |
| Extracteur de micropipettes | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procédure : étape 1, Chaleur : 290, Force :300, Distance :1.00, Délai :50. Étape 2, Chaleur : 290, Force :300, Distance :2.21, Délai :50 ; |
| Picopompe pneumatique | World Precision Instruments | PV 830 | Éjection : 20 psi ; ; Portée : 100ms ; Durée : chronométré |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Boîtes de Pétri carrées | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP | nanobody Chromotek | gt |
Références
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., D....
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Réimpressions et autorisations
