Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.
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Article de méthode
Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétiolement, l’une des étapes les plus dramatiques du cycle de vie des plantes. Le processus étroitement contrôlé et hautement dynamique de la biosynthèse de la chlorophylle est déclenché lors du passage de l’obscurité à la lumière chez les plantes à fleurs. Au moment où les plantules étiolées sont exposées aux premières traces de lumière du soleil, la conversion rapide (en quelques secondes) du protochlorophyllide en chlorophyllide est médiée par des complexes protéiques uniques acceptant la lumière, conduisant via des étapes métaboliques ultérieures à la production de chlorophylle pleinement fonctionnelle. Les techniques standard d’analyse de la teneur en chlorophylle comprennent l’extraction de pigments à partir de tissus végétaux détachés, ce qui ne s’applique pas à l’étude de processus aussi rapides. Pour étudier la cinétique de la chlorophylle in vivo avec une grande précision et une résolution spatio-temporelle dans les premières heures après la désétiolement induite par la lumière, un instrument et un protocole ont été développés. Nous présentons ici une procédure détaillée conçue pour une quantification statistiquement robuste de la chlorophylle dans les premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis .
Introduction
La désétiolation représente la phase la plus spectaculaire du cycle de vie des plantes, caractérisée par un certain nombre de changements morphologiques et un réarrangement complet du métabolisme des plantes (d’hétérotropique à autotropique)1. La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétioleation induite par la lumière chez les plantes et un processus très dynamique. La formation de chlorophylle à partir de protochlorophyllide précurseur produit à l’obscurité doit être étroitement coordonnée pour éviter les dommages dus aux sous-produits réactifs2. La réduction des protochlorophyllides en chlorophyllide est catalysée par des protochlorophyllides oxydoréductases (POR) dépendantes de la lumière, des enzymes uniques activées directement par la lumière. La réaction est très rapide, se déroulant de l’ordre de ms às 3, conduisant à une accumulation de chlorophylle reconnaissable en quelques minutes après l’irradiation des plantules étiolées 4,5,6. Il faut plus de temps (de quelques heures à quelques jours) pour que la biogenèse des chloroplastes établisse un appareil photosynthétique pleinement fonctionnel3.
Diverses méthodes existent pour analyser la teneur en chlorophylle, notamment la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou la spectrophotométrie. Habituellement, ces techniques exigent la destruction des tissus végétaux 4,5,6, limitant la détermination des changements dans les niveaux de chlorophylle au fil du temps. Les méthodes permettant l’établissement d’une cinétique de chlorophylle non invasive peuvent ouvrir une toute nouvelle perspective pour étudier les plantes sous divers aspects allant des questions de recherche fondamentale, telles que l’analyse du processus de synthèse de la chlorophylle dans le temps et l’espace, à des applications plus pratiques, telles que l’évaluation de la tolérance au stress ou l’effet des biostimulants sur la cinétique de la chlorophylle. Compte tenu de cela, nous avons introduit un système de surveillance de la formation de chlorophylle, iReenCAM7. Il intègre une caméra CCD, des filtres d’émission, des sources lumineuses et un pipeline pour l’analyse automatisée de la fluorescence (Figure 1). La principale caractéristique du dispositif développé est une résolution spatiale et temporelle élevée, surpassant les paramètres utilisés dans les approches actuelles, et une sensibilité et une spécificité suffisantes par rapport aux méthodes analytiques standard7.
La procédure non invasive décrite ici nécessite un minimum de réactifs et comprend des étapes simples, permettant d’obtenir un profil cinétique de chlorophylle chez des plantules vivantes d’Arabidopsis pendant les très premiers stades de la désétiole. Le protocole peut être utile pour l’étude d’un processus hautement dynamique de synthèse de la chlorophylle influencé par un certain nombre de facteurs, à la fois exogènes (sel, sécheresse, biostimulants, métaux lourds, etc.) et endogènes (généralement associés à des changements dans l’activité des gènes) d’origine sans qu’il soit nécessaire de détacher un tissu végétal, évitant ainsi un stress supplémentaire.
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Protocole
1. Préparation moyenne
- Préparer le milieu de culture en mélangeant 0,75 g d’agent gélifiant avec 50 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille en verre pour obtenir une concentration de 1,5 % (p/v) pour une plaque de Petri (120 x 120 x 17 mm). Secouez doucement le mélange puis faites-le chauffer au micro-ondes jusqu’à ébullition pour dissoudre le gélifiant (la solution devient claire).
- Laissez le fluide refroidir à 58-60 °C avant de passer aux étapes suivantes. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.
- Utilisez des plaques de Petri avec des bords étanches à la lumière pour éviter une réflexion excessive de la lumière actinique et une autofluorescence de fond élevée pendant les mesures. Pour cela, appliquez du ruban adhésif noir (ou d’autres moyens disponibles) pour couvrir tous les côtés de la plaque de Petri vide (Figure 2).
- Effectuer la stérilisation de la ou des plaques après l’application du ruban par irradiation avec une lampe UV germicide pendant 20 à 30 min.
- Si l’expérience implique un traitement chimique (c.-à-d. facteurs de stress abiotiques/biotiques, hormones végétales et/ou régulateurs de croissance, etc.), ajoutez la quantité appropriée de produit chimique correspondant directement au milieu. Soyez conscient de l’ajout d’une stabilité chimique choisie au milieu (par exemple, si le produit chimique n’est pas thermostable, ajoutez-le au milieu lorsqu’il est refroidi juste avant de le verser dans la plaque). Bien mélanger le milieu en agitant pour assurer une répartition uniforme du produit chimique.
- Éviter d’éclairer les plaques à la lumière UV après le versement du milieu (cela entraînerait la production de radicaux oxygénés qui pourraient interférer avec l’expérience).
- Verser le milieu préparé dans la ou les plaques de Petri carrées et laisser le milieu se solidifier à température ambiante.
2. Stérilisation de la surface des semences et conditions de croissance des plantes
- Obtenez la quantité requise de graines d’Arabidopsis thaliana Col-0 dans le réservoir (10-20 mg) et ajoutez-la dans un tube de microcentrifugation de 2 ml.
NOTE : Aucune modification spécifique n’est nécessaire lors de l’utilisation de différentes lignées d’Arabidopsis (lignées d’écotype/mutantes). La révision de la grille de sciage et les étapes de mesure doivent être effectuées pour les autres espèces végétales en tenant compte des différences de taille des graines, de taux de germination et de taille des semis. - Stérilisez les graines d’Arabidopsis en surface en ajoutant 70 % d’éthanol dans le tube pendant 2 minutes. Secouez doucement les tubes pendant la stérilisation.
- Retirez l’éthanol en pipetant soigneusement, en prenant soin de ne pas perdre de graines. Lavez les graines en ajoutant de l’eau stérile dans le tube pendant 5 min pour éliminer tout résidu d’éthanol (secouez doucement les tubes pendant la période de lavage).
- Laissez les graines sédimenter au fond du tube par gravité, retirez l’eau restante.
- Rincez à nouveau les graines 2 fois avec de l’eau stérile comme décrit à l’étape 2.3 pour vous assurer qu’elles sont exemptes de tout caractère d’éthanol. Laissez les graines sédimenter au fond du tube par gravité, retirez l’eau restante.
- Ajoutez un volume égal d’eau stérile dans le tube contenant les graines pour créer une suspension d’eau de semence.
- Utiliser une grille de semis pour répartir uniformément la suspension d’eau de semence du génotype donné sur les zones sélectionnées de la plaque de milieu (figure 2 et figure supplémentaire 1). Répartissez les graines (environ 30 à 40) d’affilée dans chaque zone à l’aide d’une large pointe de pipette.
- Laissez sécher l’eau dans les zones de semences pendant environ 30 minutes, en gardant la ou les plaques ouvertes dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Scellez la plaque avec du ruban adhésif microporeux et enveloppez-la de papier d’aluminium.
- Stratification des graines pendant 3 jours à 4 °C dans l’obscurité pour (selon l’écotype utilisé) surmonter la dormance des graines et/ou favoriser une germination uniforme.
- Transférer la plaque contenant les graines stratifiées à la lumière blanche (150 μmol/m2/s) pendant 1 h pour induire la germination (déballer le film uniquement pour le traitement à la lumière).
- Après le traitement à la lumière, enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour protéger les graines de la lumière et placez-la en position verticale dans une chambre de croissance et cultivez pendant 4 jours dans l’obscurité à 21 °C.
3. Mesure et analyse de la fluorescence de la chlorophylle
- Allumez le système iReenCAM et assurez-vous que le système est prêt et correctement configuré dans le logiciel du serveur PS lancé automatiquement (par exemple, s’il y a suffisamment d’espace de stockage pour les données de l’expérience, si la caméra de fluorescence est connectée à un PC, etc.).
- Activez le logiciel Scheduler pour créer le plan expérimental de la mesure en cliquant sur Expériences > Nouvelle expérience. Donnez un nom descriptif à l’expérience et remplissez les détails (description).
- Définissez les actions requises pour l’expérience en cliquant sur Ajouter une action , ce qui mènera à la planification des actions expérimentales.
REMARQUE : Le mot action signifie ici effectuer une expérience complète (c’est-à-dire inclure toutes les étapes nécessaires pour effectuer une mesure de plaque). - Précisez les conditions d’une mesure à tour unique (c.-à-d. la durée de la période de lumière et d’obscurité).
- En cliquant sur Générer une liste , définissez les intervalles de temps entre les rondes de mesure. Choisissez l’heure à laquelle le tour commencera et se terminera (4 h au total) et les intervalles entre les tours (dans la configuration actuelle un tour toutes les 2 min).
- Cliquez sur Générer et assurez-vous que la période et les intervalles entre les impulsions lumineuses sont corrects en vérifiant la liste générée sur le côté gauche de l’écran.
- Choisissez le protocole de mesure (Figure supplémentaire 2). Enregistrez toutes les modifications apportées à la base de données pour référence ultérieure.
- Juste avant le début de la mesure, utilisez une lumière verte de faible intensité (voir tableau des matériaux) à l’intérieur de la chambre noire et ajustez le niveau de l’étagère à l’intérieur de la chambre de mesure ou effectuez d’autres étapes de préparation avant de retirer la feuille de la plaque de Petri. Éteignez ensuite la lumière et transférez les plaques dans la chambre de mesure dans l’obscurité totale.
- Retirez délicatement le papier d’aluminium recouvrant la plaque de Petri contenant les plants de 4 jours. Placez la plaque de Petri horizontalement à l’intérieur de la chambre de mesure de l’appareil. À l’intérieur de la chambre, induire des impulsions lumineuses actiniques et effectuer l’imagerie selon le plan d’expérience (actions) défini aux étapes 3.1-3.7.
REMARQUE : Il est essentiel d’éviter tout éclairage des plaques avec des plantules étiolées avant de les placer dans la chambre de mesure. La manipulation avec la plaque avec des plantules étiolées doit être effectuée dans la chambre noire (pour un éventuel montage expérimental, voir la figure supplémentaire 3).
4. Extraction et analyse des données
- Une fois la mesure terminée, ouvrez l’expérience correspondante dans le logiciel de l’analyseur.
- Pour analyser la fluorescence des semis, générez deux types de masques : un masque rugueux (plateau) qui couvre la zone où se trouvent les semis, et un masque (végétal) précis qui ne couvre que le tissu d’intérêt (généralement des cotylédons).
- Générez un masque de barre d’état en cliquant sur l’option Créer un nouveau type de barre d’état. Attribuez les noms de génotype appropriés aux zones respectives de l’image de la plaque.
- Pour attribuer le génotype, choisissez un numéro d’image à Arrondi , puis cliquez sur Charger l’image dans la partie supérieure de l’écran. L’image de la plaque s’affichera à l’écran. En cliquant sur l’un des boutons qui représentent différents outils de dessin de formes (Figure supplémentaire 4), entrez dans le mode Nouvelle forme qui permet de dessiner la zone d’intérêt sur l’image de la plaque. Choisissez les zones nécessaires (par exemple, différents génotypes sur la plaque) et fournissez leur nom approprié.
- Cliquez sur Échap pour quitter le mode de forme. Enregistrez le masque de barre d’état généré (après lui avoir donné un nom) en cliquant sur Type de barre d’état de la boutique.
- Revenez en arrière et appliquez le masque généré lors des étapes précédentes en sélectionnant son nom dans l’option Modifier par type de bac .
- Pour générer un masque végétal avec une grande précision, utilisez l’image acquise après 180 min de mesure (environ 91) pour définir la valeur seuil minimale d’intensité du signal de fluorescence, permettant la soustraction du bruit de fond. Pour cela, supprimez la coche du seuil automatique et définissez un seuil manuel sur 0 (Figure supplémentaire 4).
- Cliquez sur Aperçu pour vous assurer que le masque de plateau couvre toutes les zones nécessaires (génotypes) sur l’image de la plaque. Pour cela, choisissez le tour 91 et cliquez sur Actualiser l’aperçu.
- Entrez dans le menu Exécuter en cliquant sur Exécuter. Exécutez l’analyse exclusivement pour le tour 91 en cochant uniquement le tour 91. Choisissez ensuite le chemin de sortie et cliquez sur Démarrer l’analyse.
- Une fois l’analyse terminée, le menu Terminer s’ouvrira automatiquement. Choisissez le tour exécuté (ce sera le seul) dans les expériences et cliquez sur Basculer l’analyseur vers les données analysées pour exporter les données pour ce point temporel spécifique (tour 91).
- Extrayez le fichier .xsel de l’archive exportée, car ce fichier contient les informations essentielles du masque végétal en cliquant sur l’icône Ouvrir l’article d’exportation .
- Rouvrez l’expérience en cliquant sur l’icône Ouvrir la partie d’analyse locale . Entrez à nouveau dans le menu Mask Builder , cliquez sur Charger l’image, choisissez le tour 1, puis Charger à partir d’un fichier dans le coin supérieur droit de l’écran et chargez le fichier .xsel précédemment extrait. L’image de la plaque sera affichée avec le masque de plateau appliqué.
- Enregistrez le masque en cliquant sur Enregistrer le type de bac et appliquez-le en sélectionnant son nom dans l’option Modifier par type de bac .
- Générez le masque végétal en ajustant le seuil d’intensité du signal de fluorescence. Augmentez la valeur du seuil manuel jusqu’à ce que le masque généré dans le menu Aperçu corresponde parfaitement au retour sur investissement (par exemple, les cotylédons) dans chacun des génotypes (figure supplémentaire 4). Vérifiez si le masque s’adapte à tous les tours de mesures en faisant défiler les tours (vérifier le bon positionnement du masque aux tours 1, 61 et 121 devrait suffire) dans le menu Aperçu .
- Effectuez l’analyse de toutes les rondes de mesure et exportez les données.
REMARQUE : Le fichier de sortie comprend les valeurs de fluorescence de la chlorophylle d’un génotype donné pour chaque point temporel, ce qui permet de construire des graphiques de choix et de faciliter une évaluation statistique plus approfondie.
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Résultats
La production typique obtenue à l’aide de la procédure nouvellement mise au point dans les semis d’Arabidopsis désétiolés âgés de 4 jours de type sauvage (WT), l’écotype Columbia-0 (Col-0) est illustrée à la figure 3. Dans des conditions de contrôle (milieu MS supplémenté en DMSO), la courbe de biosynthèse de la chlorophylle commence par une première poussée de la synthèse de la chlorophylle, dans laquelle le pool de protochlorphyllides synthétisé pendant la phase scotomorphogénique...
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Discussion
Étapes critiques du protocole et du dépannage - pas de lumière et prendre soin du masque
Comme le souligne directement la description du protocole ci-dessus, il est d’une importance cruciale d’éviter même les traces de lumière pendant la culture des semis de plantes étiolées ou juste avant de commencer le protocole11. Dans notre installation, nous utilisons une chambre noire dédiée située dans le phytotron et séparée du reste du phytotron par une porte rotative étanche à la lum...
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Déclarations de divulgation
Z.B. et K.P. sont des employés du PSI et Martin Trtilek est PDG et propriétaire de la société PSI produisant l’iReenCAM. Tous ces auteurs ont participé à l’élaboration de l’instrument tel que décrit précédemment7.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Fonds européen de développement régional-Projet SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Ce projet a reçu un financement dans le cadre du projet MSCA4Ukraine (ID 1233580), qui est financé par l’Union européenne. Nous remercions Lenka Sochurkova pour la conception graphique de la figure 1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Feuille d’aluminium | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 grainescollection | NASC | N1092 | |
| Chambre de culture | PSI | sur mesure | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf monocanal, variable (100-1000 &mu ; L) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| Dispositif iReenCAM | PSI | sur mesure/prototype | |
| Flacons de laboratoire, avec bouchons (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Boîte à flux laminaire | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Ruban d’épissure en caoutchouc sans doublure, largeur 19 mm, noir, Scotch | 3M Science. Appliqué à la vie | 7000006085 | |
| Tube de microcentrifugation, 2 mL avec couvercle, PPT, MARQUE | Merck | BR780546-500EA | |
| Ruban microporeux | 3M Science. Appliqué à Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux vert l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Plaques de Petri - Plats Greiner, carrés, 120 x 120 x17mm, ventilés | Merck | Z617679-240EA | |
| Pointes de pipette, 1000 &mu ; L, Axygen, | Merck | AXYT1000B | |
| Le logiciel d’analyse de données Plant Screen | PSI | livré dans le cadre de l’iReenCAM |
Références
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Réimpressions et autorisations
