Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis

Summary

Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.

Abstract

La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétiolement, l’une des étapes les plus dramatiques du cycle de vie des plantes. Le processus étroitement contrôlé et hautement dynamique de la biosynthèse de la chlorophylle est déclenché lors du passage de l’obscurité à la lumière chez les plantes à fleurs. Au moment où les plantules étiolées sont exposées aux premières traces de lumière du soleil, la conversion rapide (en quelques secondes) du protochlorophyllide en chlorophyllide est médiée par des complexes protéiques uniques acceptant la lumière, conduisant via des étapes métaboliques ultérieures à la production de chlorophylle pleinement fonctionnelle. Les techniques standard d’analyse de la teneur en chlorophylle comprennent l’extraction de pigments à partir de tissus végétaux détachés, ce qui ne s’applique pas à l’étude de processus aussi rapides. Pour étudier la cinétique de la chlorophylle in vivo avec une grande précision et une résolution spatio-temporelle dans les premières heures après la désétiolement induite par la lumière, un instrument et un protocole ont été développés. Nous présentons ici une procédure détaillée conçue pour une quantification statistiquement robuste de la chlorophylle dans les premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis .

Introduction

La désétiolation représente la phase la plus spectaculaire du cycle de vie des plantes, caractérisée par un certain nombre de changements morphologiques et un réarrangement complet du métabolisme des plantes (d’hétérotropique à autotropique)¹. La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétioleation induite par la lumière chez les plantes et un processus très dynamique. La formation de chlorophylle à partir de protochlorophyllide précurseur produit à l’obscurité doit être étroitement coordonnée pour éviter les dommages dus aux sous-produits réactifs². La réduction des protochlorophyllides en chlorophyllide est catalysée par des protochlorophyllides oxydoréductases (POR) dépendantes de la lumière, des enzymes uniques activées directement par la lumière. La réaction est très rapide, se déroulant de l’ordre de ms à^{s 3}, conduisant à une accumulation de chlorophylle reconnaissable en quelques minutes après l’irradiation des plantules étiolées ^4,5,6. Il faut plus de temps (de quelques heures à quelques jours) pour que la biogenèse des chloroplastes établisse un appareil photosynthétique pleinement fonctionnel³.

Diverses méthodes existent pour analyser la teneur en chlorophylle, notamment la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) ou la spectrophotométrie. Habituellement, ces techniques exigent la destruction des tissus végétaux ^4,5,6, limitant la détermination des changements dans les niveaux de chlorophylle au fil du temps. Les méthodes permettant l’établissement d’une cinétique de chlorophylle non invasive peuvent ouvrir une toute nouvelle perspective pour étudier les plantes sous divers aspects allant des questions de recherche fondamentale, telles que l’analyse du processus de synthèse de la chlorophylle dans le temps et l’espace, à des applications plus pratiques, telles que l’évaluation de la tolérance au stress ou l’effet des biostimulants sur la cinétique de la chlorophylle. Compte tenu de cela, nous avons introduit un système de surveillance de la formation de chlorophylle, iReenCAM⁷. Il intègre une caméra CCD, des filtres d’émission, des sources lumineuses et un pipeline pour l’analyse automatisée de la fluorescence (Figure 1). La principale caractéristique du dispositif développé est une résolution spatiale et temporelle élevée, surpassant les paramètres utilisés dans les approches actuelles, et une sensibilité et une spécificité suffisantes par rapport aux méthodes analytiques standard⁷.

La procédure non invasive décrite ici nécessite un minimum de réactifs et comprend des étapes simples, permettant d’obtenir un profil cinétique de chlorophylle chez des plantules vivantes d’Arabidopsis pendant les très premiers stades de la désétiole. Le protocole peut être utile pour l’étude d’un processus hautement dynamique de synthèse de la chlorophylle influencé par un certain nombre de facteurs, à la fois exogènes (sel, sécheresse, biostimulants, métaux lourds, etc.) et endogènes (généralement associés à des changements dans l’activité des gènes) d’origine sans qu’il soit nécessaire de détacher un tissu végétal, évitant ainsi un stress supplémentaire.

Protocol

1. Préparation moyenne

1. Préparer le milieu de culture en mélangeant 0,75 g d’agent gélifiant avec 50 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille en verre pour obtenir une concentration de 1,5 % (p/v) pour une plaque de Petri (120 x 120 x 17 mm). Secouez doucement le mélange puis faites-le chauffer au micro-ondes jusqu’à ébullition pour dissoudre le gélifiant (la solution devient claire).
2. Laissez le fluide refroidir à 58-60 °C avant de passer aux étapes suivantes. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.
3. Utilisez des plaques de Petri avec des bords étanches à la lumière pour éviter une réflexion excessive de la lumière actinique et une autofluorescence de fond élevée pendant les mesures. Pour cela, appliquez du ruban adhésif noir (ou d’autres moyens disponibles) pour couvrir tous les côtés de la plaque de Petri vide (Figure 2).
4. Effectuer la stérilisation de la ou des plaques après l’application du ruban par irradiation avec une lampe UV germicide pendant 20 à 30 min.
5. Si l’expérience implique un traitement chimique (c.-à-d. facteurs de stress abiotiques/biotiques, hormones végétales et/ou régulateurs de croissance, etc.), ajoutez la quantité appropriée de produit chimique correspondant directement au milieu. Soyez conscient de l’ajout d’une stabilité chimique choisie au milieu (par exemple, si le produit chimique n’est pas thermostable, ajoutez-le au milieu lorsqu’il est refroidi juste avant de le verser dans la plaque). Bien mélanger le milieu en agitant pour assurer une répartition uniforme du produit chimique.
6. Éviter d’éclairer les plaques à la lumière UV après le versement du milieu (cela entraînerait la production de radicaux oxygénés qui pourraient interférer avec l’expérience).
7. Verser le milieu préparé dans la ou les plaques de Petri carrées et laisser le milieu se solidifier à température ambiante.

2. Stérilisation de la surface des semences et conditions de croissance des plantes

1. Obtenez la quantité requise de graines d’Arabidopsis thaliana Col-0 dans le réservoir (10-20 mg) et ajoutez-la dans un tube de microcentrifugation de 2 ml.
   NOTE : Aucune modification spécifique n’est nécessaire lors de l’utilisation de différentes lignées d’Arabidopsis (lignées d’écotype/mutantes). La révision de la grille de sciage et les étapes de mesure doivent être effectuées pour les autres espèces végétales en tenant compte des différences de taille des graines, de taux de germination et de taille des semis.
2. Stérilisez les graines d’Arabidopsis en surface en ajoutant 70 % d’éthanol dans le tube pendant 2 minutes. Secouez doucement les tubes pendant la stérilisation.
3. Retirez l’éthanol en pipetant soigneusement, en prenant soin de ne pas perdre de graines. Lavez les graines en ajoutant de l’eau stérile dans le tube pendant 5 min pour éliminer tout résidu d’éthanol (secouez doucement les tubes pendant la période de lavage).
4. Laissez les graines sédimenter au fond du tube par gravité, retirez l’eau restante.
5. Rincez à nouveau les graines 2 fois avec de l’eau stérile comme décrit à l’étape 2.3 pour vous assurer qu’elles sont exemptes de tout caractère d’éthanol. Laissez les graines sédimenter au fond du tube par gravité, retirez l’eau restante.
6. Ajoutez un volume égal d’eau stérile dans le tube contenant les graines pour créer une suspension d’eau de semence.
7. Utiliser une grille de semis pour répartir uniformément la suspension d’eau de semence du génotype donné sur les zones sélectionnées de la plaque de milieu (figure 2 et figure supplémentaire 1). Répartissez les graines (environ 30 à 40) d’affilée dans chaque zone à l’aide d’une large pointe de pipette.
8. Laissez sécher l’eau dans les zones de semences pendant environ 30 minutes, en gardant la ou les plaques ouvertes dans une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination. Scellez la plaque avec du ruban adhésif microporeux et enveloppez-la de papier d’aluminium.
9. Stratification des graines pendant 3 jours à 4 °C dans l’obscurité pour (selon l’écotype utilisé) surmonter la dormance des graines et/ou favoriser une germination uniforme.
10. Transférer la plaque contenant les graines stratifiées à la lumière blanche (150 μmol/m²/s) pendant 1 h pour induire la germination (déballer le film uniquement pour le traitement à la lumière).
11. Après le traitement à la lumière, enveloppez la plaque avec du papier d’aluminium pour protéger les graines de la lumière et placez-la en position verticale dans une chambre de croissance et cultivez pendant 4 jours dans l’obscurité à 21 °C.

3. Mesure et analyse de la fluorescence de la chlorophylle

1. Allumez le système iReenCAM et assurez-vous que le système est prêt et correctement configuré dans le logiciel du serveur PS lancé automatiquement (par exemple, s’il y a suffisamment d’espace de stockage pour les données de l’expérience, si la caméra de fluorescence est connectée à un PC, etc.).
2. Activez le logiciel Scheduler pour créer le plan expérimental de la mesure en cliquant sur Expériences > Nouvelle expérience. Donnez un nom descriptif à l’expérience et remplissez les détails (description).
3. Définissez les actions requises pour l’expérience en cliquant sur Ajouter une action , ce qui mènera à la planification des actions expérimentales.
   REMARQUE : Le mot action signifie ici effectuer une expérience complète (c’est-à-dire inclure toutes les étapes nécessaires pour effectuer une mesure de plaque).
4. Précisez les conditions d’une mesure à tour unique (c.-à-d. la durée de la période de lumière et d’obscurité).
5. En cliquant sur Générer une liste , définissez les intervalles de temps entre les rondes de mesure. Choisissez l’heure à laquelle le tour commencera et se terminera (4 h au total) et les intervalles entre les tours (dans la configuration actuelle un tour toutes les 2 min).
6. Cliquez sur Générer et assurez-vous que la période et les intervalles entre les impulsions lumineuses sont corrects en vérifiant la liste générée sur le côté gauche de l’écran.
7. Choisissez le protocole de mesure (Figure supplémentaire 2). Enregistrez toutes les modifications apportées à la base de données pour référence ultérieure.
8. Juste avant le début de la mesure, utilisez une lumière verte de faible intensité (voir tableau des matériaux) à l’intérieur de la chambre noire et ajustez le niveau de l’étagère à l’intérieur de la chambre de mesure ou effectuez d’autres étapes de préparation avant de retirer la feuille de la plaque de Petri. Éteignez ensuite la lumière et transférez les plaques dans la chambre de mesure dans l’obscurité totale.
9. Retirez délicatement le papier d’aluminium recouvrant la plaque de Petri contenant les plants de 4 jours. Placez la plaque de Petri horizontalement à l’intérieur de la chambre de mesure de l’appareil. À l’intérieur de la chambre, induire des impulsions lumineuses actiniques et effectuer l’imagerie selon le plan d’expérience (actions) défini aux étapes 3.1-3.7.
   REMARQUE : Il est essentiel d’éviter tout éclairage des plaques avec des plantules étiolées avant de les placer dans la chambre de mesure. La manipulation avec la plaque avec des plantules étiolées doit être effectuée dans la chambre noire (pour un éventuel montage expérimental, voir la figure supplémentaire 3).

4. Extraction et analyse des données

1. Une fois la mesure terminée, ouvrez l’expérience correspondante dans le logiciel de l’analyseur.
2. Pour analyser la fluorescence des semis, générez deux types de masques : un masque rugueux (plateau) qui couvre la zone où se trouvent les semis, et un masque (végétal) précis qui ne couvre que le tissu d’intérêt (généralement des cotylédons).
3. Générez un masque de barre d’état en cliquant sur l’option Créer un nouveau type de barre d’état. Attribuez les noms de génotype appropriés aux zones respectives de l’image de la plaque.
4. Pour attribuer le génotype, choisissez un numéro d’image à Arrondi , puis cliquez sur Charger l’image dans la partie supérieure de l’écran. L’image de la plaque s’affichera à l’écran. En cliquant sur l’un des boutons qui représentent différents outils de dessin de formes (Figure supplémentaire 4), entrez dans le mode Nouvelle forme qui permet de dessiner la zone d’intérêt sur l’image de la plaque. Choisissez les zones nécessaires (par exemple, différents génotypes sur la plaque) et fournissez leur nom approprié.
5. Cliquez sur Échap pour quitter le mode de forme. Enregistrez le masque de barre d’état généré (après lui avoir donné un nom) en cliquant sur Type de barre d’état de la boutique.
6. Revenez en arrière et appliquez le masque généré lors des étapes précédentes en sélectionnant son nom dans l’option Modifier par type de bac .
7. Pour générer un masque végétal avec une grande précision, utilisez l’image acquise après 180 min de mesure (environ 91) pour définir la valeur seuil minimale d’intensité du signal de fluorescence, permettant la soustraction du bruit de fond. Pour cela, supprimez la coche du seuil automatique et définissez un seuil manuel sur 0 (Figure supplémentaire 4).
8. Cliquez sur Aperçu pour vous assurer que le masque de plateau couvre toutes les zones nécessaires (génotypes) sur l’image de la plaque. Pour cela, choisissez le tour 91 et cliquez sur Actualiser l’aperçu.
9. Entrez dans le menu Exécuter en cliquant sur Exécuter. Exécutez l’analyse exclusivement pour le tour 91 en cochant uniquement le tour 91. Choisissez ensuite le chemin de sortie et cliquez sur Démarrer l’analyse.
10. Une fois l’analyse terminée, le menu Terminer s’ouvrira automatiquement. Choisissez le tour exécuté (ce sera le seul) dans les expériences et cliquez sur Basculer l’analyseur vers les données analysées pour exporter les données pour ce point temporel spécifique (tour 91).
11. Extrayez le fichier .xsel de l’archive exportée, car ce fichier contient les informations essentielles du masque végétal en cliquant sur l’icône Ouvrir l’article d’exportation .
12. Rouvrez l’expérience en cliquant sur l’icône Ouvrir la partie d’analyse locale . Entrez à nouveau dans le menu Mask Builder , cliquez sur Charger l’image, choisissez le tour 1, puis Charger à partir d’un fichier dans le coin supérieur droit de l’écran et chargez le fichier .xsel précédemment extrait. L’image de la plaque sera affichée avec le masque de plateau appliqué.
13. Enregistrez le masque en cliquant sur Enregistrer le type de bac et appliquez-le en sélectionnant son nom dans l’option Modifier par type de bac .
14. Générez le masque végétal en ajustant le seuil d’intensité du signal de fluorescence. Augmentez la valeur du seuil manuel jusqu’à ce que le masque généré dans le menu Aperçu corresponde parfaitement au retour sur investissement (par exemple, les cotylédons) dans chacun des génotypes (figure supplémentaire 4). Vérifiez si le masque s’adapte à tous les tours de mesures en faisant défiler les tours (vérifier le bon positionnement du masque aux tours 1, 61 et 121 devrait suffire) dans le menu Aperçu .
15. Effectuez l’analyse de toutes les rondes de mesure et exportez les données.
    REMARQUE : Le fichier de sortie comprend les valeurs de fluorescence de la chlorophylle d’un génotype donné pour chaque point temporel, ce qui permet de construire des graphiques de choix et de faciliter une évaluation statistique plus approfondie.

Results

La production typique obtenue à l’aide de la procédure nouvellement mise au point dans les semis d’Arabidopsis désétiolés âgés de 4 jours de type sauvage (WT), l’écotype Columbia-0 (Col-0) est illustrée à la figure 3. Dans des conditions de contrôle (milieu MS supplémenté en DMSO), la courbe de biosynthèse de la chlorophylle commence par une première poussée de la synthèse de la chlorophylle, dans laquelle le pool de protochlorphyllides synthétisé pendant la phase scotomorphogénique de la croissance, est rapidement converti en chlorophylle en raison des POR induits par la lumière ^7,8,9. La phase initiale d’accumulation rapide de chlorophylle dure environ 10 minutes et est suivie d’une phase de latence, au cours de laquelle les minima du protochlorophyllide synthétisé par l’obscurité sont atteints (environ 30 min après l’irradiation ; pour la courbe de protochlorophyllide mesurée par HPLC, voir⁷). Pendant la phase de latence, les gènes de biosynthèse de la chlorophylle sont régulés à la hausse¹⁰, ce qui conduit à la production de protochlorophyllide induite par la lumière. Le protochlorophyllide nouvellement synthétisé est rapidement converti en chlorophylle, détectable en phase exponentielle (dans le cas de WT Col-0 commençant environ 120 min après l’irradiation), se terminant par une autre phase de latence à environ 4 h après l’irradiation des plantules désétiolées (Figure 3). En présence de 6-benzylaminopurine (BAP), les premières différences significatives sont détectables au cours de la phase exponentielle⁷, suggérant un effet négatif de la BAP sur la cinétique de la chlorophylle dans les stades ultérieurs de la biosynthèse de la chlorophylle (environ 2 h après le début de l’illumination à la lumière actinique ; Figure 3).

Pour comparer différentes conditions et/ou génotypes, la normalisation des données brutes est nécessaire. Comme aucune chlorophylle n’était détectable par HPLC dans diverses conditions et/ou différents génotypes chez les plantules étiolées, nous avons effectué la normalisation (F/F0) aux niveaux de fluorescence T0 (F0) mesurés pour le traitement et/ou le génotype⁷ correspondants. Pour démontrer l’importance de la normalisation, nous présentons à la fois les données brutes et les données normalisées à la valeur moyenne de fluorescence chlorophyllienne du témoin mesurée à T0 (F0 ; Figure 3A et Figure 3B, respectivement).

Figure 1 : Présentation du protocole de l’appareil de mesure. Le schéma du pipeline de mesure et d’analyse iReenCAM. (A) Préparation des échantillons par semis de graines défini par grille, stratification, induction lumineuse de la germination et culture de la plaque de Petri orientée verticalement dans l’obscurité. (B) Le module de contrôle pour l’acquisition automatique et programmable d’images et la gestion des données basé sur la boîte à outils logicielle de phénotypage PlantScreen organise le fonctionnement de l’ensemble du système en contrôlant et en synchronisant le fonctionnement du matériel avec le protocole de mesure et d’analyse défini par l’utilisateur. (C) Le protocole de mesure est conçu pour des mesures dynamiques des images d’échantillons fluorescents à des intervalles de 2 minutes pendant 4 h au total, soit 120 tours de mesure. Le cadre visuel temporel d’une image représentative en fausses couleurs de semis d’Arabidopsis âgés de 4 jours orientés verticalement acquis à 180 min est utilisé pour la génération de masques ROI. (D) Un masque définissant la zone d’intérêt pour un tissu d’intérêt (par exemple, cotylédon, hypocotyle ou zone racinaire) est appliqué sur l’image visuelle temporelle, une soustraction de l’arrière-plan est effectuée et les valeurs de fluorescence pixel par pixel pour chaque zone d’intérêt (définie par le masque de la plante) de tous les cycles de mesure sont extraites. Enfin, les données brutes (fluorescence F) sont normalisées à la valeur moyenne de fluorescence à T0 (F0). Barres d’échelle = 1 cm (A) et 0,25 cm (C). La figure a été modifiée de⁷. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Placement des semences. La figure montre le placement des graines d’Arabidopsis sur la plaque de Petri avec des bords étanches à la lumière à l’aide de la grille de sciage. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Cinétique d’accumulation de la chlorophylle dans les premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis. Les semis étiolés WT Col-0 ont été cultivés sur un milieu supplémenté en BAP ou DMSO (mock). (A) La valeur moyenne ± SD (zone ombrée), n = 9 des données brutes et (B) les données normalisées à la valeur moyenne de fluorescence à T0 (F0). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Grille de semis. À gauche : Grille de semis avec des cases rectangulaires délimitées pour placer les graines de chaque génotype dans un point de mesure situé dans la zone d’homogénéité de la lumière actinique (intensité lumineuse ≥ 0,7 de l’intensité lumineuse maximale). À droite : Représentation schématique de semis d’Arabidopsis étiolés âgés de 4 jours cultivés pour l’analyse. La grille de semis fournit un schéma possible pour le positionnement des graines d’Arabidopsis assurant une homogénéité de la lumière et une densité de semence appropriée (chaque fente peut être utilisée pour le placement des graines car la taille d’une fente, la distance entre les fentes et l’homogénéité de la lumière dans la zone de la grille sont unifiées). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Protocole de mesure de fluorescence. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Configuration expérimentale permettant d’éviter une exposition à la lumière indésirable. (A) L’appareil de mesure est placé dans le phytotron walk-in, (B) dans la chambre séparée par une porte étanche à la lumière. (C) Les boîtes de culture in vitro (pointe de flèche rouge) dédiées à la croissance des plantules étiolées dans des conditions définies (température et humidité relative) sont placées juste sous l’appareil (pointe de flèche jaune), assurant un risque minimal d’exposition à la lumière. La source de lumière tamisée verte (pointe de flèche bleue) est montée sur le mur à côté du PC de commande (pointe de flèche orange). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Procédure de génération de masques dans le flux de travail à l’aide du logiciel d’analyse de données PS. Imprimez des captures d’écran des étapes individuelles à effectuer pour la génération du masque de plateau (étapes 4.3-4.6) et du masque végétal (étape 4.12) et l’analyse des données (étapes 4.7 et 4.13). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Densité de semis affectant la variabilité des mesures. Cinétique d’accumulation de chlorophylle chez des plantules d’Arabidopsis WT Col-0 étiolées âgées de 4 jours cultivées ( A) séparément (sous forme de plantules individuelles, ici n = 5) ou dans un groupe de (B) densité élevée (HD, n = 30-40) ou (C) faible densité (LD, n = 10-15). Le n correspond au nombre de plants par emplacement de la grille de semis, les données représentent les valeurs moyennes ± SD (région ombrée). La densité élevée ou faible correspond au nombre de plants par emplacement de la grille de semis comme mentionné. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : L’intervalle et l’espace de culture nécessitent une optimisation spécifique à l’espèce. Croissance de diverses espèces végétales à l’aide du protocole optimisé par Arabidopsis. (A) Placement des graines sur la grille de semis. (B) Semis étiolés de 4 jours d’Arabidopsis thaliana, de Brassica napus et de Crambe abyssinica, âgés de 4 jours. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Étapes critiques du protocole et du dépannage - pas de lumière et prendre soin du masque
Comme le souligne directement la description du protocole ci-dessus, il est d’une importance cruciale d’éviter même les traces de lumière pendant la culture des semis de plantes étiolées ou juste avant de commencer le protocole¹¹. Dans notre installation, nous utilisons une chambre noire dédiée située dans le phytotron et séparée du reste du phytotron par une porte rotative étanche à la lumière (Figure supplémentaire 3). La chambre est équipée d’un espace de culture des plantes et d’un établi permettant d’accueillir l’appareil avec un PC de contrôle et une hotte. Cela nous permet à la fois de faire pousser les plantes dans l’obscurité et de commencer la mesure sans avoir besoin de transporter des plaques.

La méthode de culture des plantes et de génération de masques est essentielle pour la quantification ultérieure du signal de fluorescence de la chlorophylle via le test proposé. Il faut éviter d’avoir des amas d’agent gélifiant ou de petits déchets visuels / poussière dans les médias car cela pourrait provoquer une réflexion de la lumière. Comme la reconnaissance de la fluorescence de la chlorophylle par le logiciel est limitée par le masque, une zone végétale qui ne sera pas couverte par le masque ne sera tout simplement pas analysée par le logiciel. Pendant la mesure de 4 heures, les plantules grandissent/bougent un peu, donc le masque désigné peut nécessiter des ajustements car il peut ne pas passer par tous les cycles de mesure pour la quantification précise de l’intensité du signal. D’après notre expérience, la définition imparfaite du masque semble être la principale source de variabilité. Au cours des expériences d’optimisation, nous avons surveillé les changements dans la variabilité des valeurs de fluorescence de la chlorophylle prises pour analyse dans i) des semis individuels et un groupe de semis avec ii) des semis de densité plus élevée (30-40 graines) et iii) plus faible (10-15 graines) (Figure supplémentaire 5). Nous avons utilisé une densité de semis plus élevée car elle présentait la plus faible variabilité. La variabilité plus élevée observée dans le cas de semis individuels/semis à faible densité provient principalement de la proportion plus élevée de pixels situés à la limite entre le signal et l’arrière-plan et du léger mouvement des plantules pendant l’intervalle de mesure de 4 heures.

Pour vous assurer que toutes les mesures sont exactes, vérifiez si le masque végétal correspond au premier tour, puis au 15^e, 30^e, 45^e, 60^{e 75 e} et ainsi de suite jusqu’au dernier (en choisissant le numéro du tour et en cliquant sur Actualiser l’aperçu). Cela ne prendra que quelques minutes, mais garantira que toute la zone du cotylédon est couverte et évaluée. Si, à un moment donné, le masque végétal ne convient pas (la zone requise n’est pas entièrement couverte), divisez l’expérience en plusieurs parties. Effectuez ensuite le protocole à partir de l’étape 4 (4.1-4.13) pour créer un masque spécifique séparément pour chaque partie de l’expérience. Par exemple, si vous remarquez le déplacement du masque végétal au tour 60-61 (ou un peu plus tôt), divisez l’expérience en deux parties - 1^ère partie (1-60 tours) et 2^ème partie (61-121 tours). Pour la^1ère partie, utilisez l’image du tour 41 pour générer un masque végétal et pour la 2ème^partie, utilisez le tour 91. À l’étape 4.13, lors de l’analyse des données, veillez à choisir les tours en fonction de la partie correspondante de l’expérience (par exemple, les tours 1-60 pour la première partie et 61-121 pour la seconde, comme dans l’exemple ci-dessus) avant de cliquer sur Analyser. Lorsque l’on travaille avec Arabidopsis, le mouvement des plantes est négligeable car elles poussent assez lentement, mais si l’on applique le protocole pour différentes espèces (voir ci-dessous), le rythme de croissance doit être pris en compte.

Modifications et limitations
Le nombre de paramètres peut être modifié, y compris l’intensité et la longueur d’onde de la lumière actinique et/ou de la lumière appliquée entre les intervalles d’application de la lumière actinique. L’appareil de mesure comprend la roue à filtres intégrée, entièrement motorisée et commandée par logiciel. Ainsi, l’algorithme de mesure adapté à la quantification d’autres pigments, généralement aussi des produits de la voie de biosynthèse du tétrapyrolle^10,12, pourrait être inclus dans le protocole en cas d’ajout des filtres appropriés.

De plus, comme il a été mentionné précédemment, le protocole peut être utilisé non seulement pour les plantes Arabidopsis . Cependant, lorsque vous travaillez avec d’autres espèces végétales, chaque étape du protocole doit être révisée en conséquence en tenant compte des caractéristiques spécifiques de l’espèce, y compris le taux de germination et de croissance et/ou la taille (figure supplémentaire 6).

L’une des limites importantes du protocole est la durée pendant laquelle l’analyse de quantification de la chlorophylle peut être effectuée. Après l’intégration de la chlorophylle dans les complexes photosystème, le signal de fluorescence est biaisé par la consommation d’énergie de la photosynthèse (ce que l’on appelle la fluorescence variable de la chlorophylle est présente) comme cela a été observé au cours des stades ultérieurs de la désétiolement¹³. Comme analysé à l’aide du test OJIP transitoires^14,15, aucun signe d’activité photosynthétique n’a été détecté à l’aide de ce dispositif expérimental pendant les 4 premières heures de dé-étiolement⁷. Cependant, si la période prolongée de photomorphogenèse est supposée/nécessaire à analyser, le niveau d’assemblage des photosystèmes et l’effet possible de la photosynthèse sur les niveaux globaux de fluorescence doivent être testés.

Enfin, il faut mentionner que notre protocole basé sur les mesures de fluorescence, permet une quantification relative et non absolue de la chlorophylle. Si une quantification absolue est nécessaire, l’étalonnage correspondant doit être effectué à l’aide d’une autre méthode, par exemple l’approche HPLC.

Importance par rapport aux méthodes existantes - quantification simple, rapide et statistiquement robuste de la chlorophylle avec une résolution temporelle et spatiale élevée
La procédure décrite ici permet la détection et la quantification en temps réel de la chlorophylle dans les plantules vivantes d’Arabidopsis pendant les premiers stades de la désétiolement. Comparée à d’autres approches reposant principalement sur l’extraction de chlorophylle à partir de matériel végétal détaché^16,17 ou sur des méthodes optiques récemment développées^18,19, cette approche est purement non invasive, permettant la quantification de la chlorophylle par mesure in vivo de l’intensité de la fluorescence. De plus, il n’est pas nécessaire d’utiliser des réactifs supplémentaires pour la préparation des échantillons comme avec d’autres méthodes alternatives existantes, y compris les approches basées sur l’HPLC ou la spectrophotométrie susmentionnées. Le protocole nouvellement introduit est simple, rapide et précis, comme cela a été vérifié précédemment à l’aide de HPLC⁵. En utilisant les paramètres du protocole standard, la courbe finale d’une seule répétition biologique est constituée de 120 points de mesure (moyennes d’intensité de fluorescence) pris pendant 4 h de mesure, chacun comprenant jusqu’à 15 points de mesure. En règle générale, la courbe finale comprend les données de trois répliques biologiques (p. ex., trois plaques préparées indépendamment) et de trois points de mesure (trois répliques techniques), chacune composée de 30 à 40 semis. Ainsi, environ 300 plantules sont analysées dans chaque intervalle de temps, fournissant un ensemble de données statistiquement robustes, permettant de détecter de manière fiable même de petites différences, comme cela a été démontré sur des mutants affectés à différentes étapes de la biosynthèse de la chlorophylle⁷. Ici, nous encourageons l’utilisateur à utiliser l’approche statistique récemment développée basée sur des modèles mixtes linéaires généralisés combinés à des modèles de séries temporelles classiques comme outil approprié pour l’analyse des données cinétiques de la chlorophylle²⁰.

Applications futures de la technique - criblage rapide et bon marché
Les caractéristiques susmentionnées font de cette approche un outil utile adapté au criblage rapide et peu coûteux et à la quantification très précise des caractères associés (directement ou indirectement) à la biosynthèse de la chlorophylle. Cela pourrait inclure des études utilisant le criblage génétique avancé pour mieux caractériser les régulations complexes et à plusieurs niveaux de la biosynthèse de la chlorophylle 10,12,21. Compte tenu de la possibilité d’un traitement par divers composés, le protocole est également très utile pour étudier, par exemple, l’importance des régulations hormonales médiées par la lumière^22,23 ou le criblage de composés de faible poids moléculaire ayant un impact possible sur la cinétique d’accumulation de la chlorophylle.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-benzylaminopurine	Duchefa Biochemie	B0904.0001
Feuille d’aluminium	Merck	Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 grainescollection	NASC	N1092
Chambre de culture	PSI		sur mesure
Dimethilsulfoxid	Thermo Fisher Scientific	042780.AK
Eppendorf monocanal, variable (100-1000 &mu ; L)	Merck	EP3123000063
Gelrite	Duchefa Biochemie	G1101
Dispositif iReenCAM	PSI		sur mesure/prototype
Flacons de laboratoire, avec bouchons (Duran), 100mL	Merck	Z305170-10EA
Boîte à flux laminaire	UniGreenScheme	ITEM-31156
Ruban d’épissure en caoutchouc sans doublure, largeur 19 mm, noir, Scotch	3M Science. Appliqué à la vie	7000006085
Tube de microcentrifugation, 2 mL avec couvercle, PPT, MARQUE	Merck	BR780546-500EA
Ruban microporeux	3M Science. Appliqué à Life	7100225115
Osram lumilux vert l18w/66	Ovalamp	200008833
Plaques de Petri - Plats Greiner, carrés, 120 x 120 x17mm, ventilés	Merck	Z617679-240EA
Pointes de pipette, 1000 &mu ; L, Axygen,	Merck	AXYT1000B
Le logiciel d’analyse de données Plant Screen	PSI		livré dans le cadre de l’iReenCAM