Nous décrivons ici un outil avancé conçu pour le suivi de la biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement des plantules d’Arabidopsis . La nouvelle méthodologie fournit une imagerie non invasive de fluorescence de la chlorophylle en temps réel à haute résolution spatiale et temporelle.
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Article de méthode
Test non invasif pour la détermination de la cinétique de biosynthèse de la chlorophylle au cours des premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétiolement, l’une des étapes les plus dramatiques du cycle de vie des plantes. Le processus étroitement contrôlé et hautement dynamique de la biosynthèse de la chlorophylle est déclenché lors du passage de l’obscurité à la lumière chez les plantes à fleurs. Au moment où les plantules étiolées sont exposées aux premières traces de lumière du soleil, la conversion rapide (en quelques secondes) du protochlorophyllide en chlorophyllide est médiée par des complexes protéiques uniques acceptant la lumière, conduisant via des étapes métaboliques ultérieures à la production de chlorophylle pleinement fonctionnelle. Les techniques standard d’analyse de la teneur en chlorophylle comprennent l’extraction de pigments à partir de tissus végétaux détachés, ce qui ne s’applique pas à l’étude de processus aussi rapides. Pour étudier la cinétique de la chlorophylle in vivo avec une grande précision et une résolution spatio-temporelle dans les premières heures après la désétiolement induite par la lumière, un instrument et un protocole ont été développés. Nous présentons ici une procédure détaillée conçue pour une quantification statistiquement robuste de la chlorophylle dans les premiers stades de la désétiolement d’Arabidopsis .
Introduction
La désétiolation représente la phase la plus spectaculaire du cycle de vie des plantes, caractérisée par un certain nombre de changements morphologiques et un réarrangement complet du métabolisme des plantes (d’hétérotropique à autotropique)1. La biosynthèse de la chlorophylle est une caractéristique de la désétioleation induite par la lumière chez les plantes et un processus très dynamique. La formation de chlorophylle à partir de protochlorophyllide précurseur produit à l’obscurité doit être étroitement coordonnée pour éviter les dommages dus aux sous-produits réactifs2. La réduction des protochlorophyllides en chlorop....
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Protocole
1. Préparation moyenne
- Préparer le milieu de culture en mélangeant 0,75 g d’agent gélifiant avec 50 mL d’eau désionisée stérile dans une bouteille en verre pour obtenir une concentration de 1,5 % (p/v) pour une plaque de Petri (120 x 120 x 17 mm). Secouez doucement le mélange puis faites-le chauffer au micro-ondes jusqu’à ébullition pour dissoudre le gélifiant (la solution devient claire).
- Laissez le fluide refroidir à 58-60 °C avant de passer aux étapes suivantes. Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire pour éviter toute contamination.
- Ut....
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Résultats
La production typique obtenue à l’aide de la procédure nouvellement mise au point dans les semis d’Arabidopsis désétiolés âgés de 4 jours de type sauvage (WT), l’écotype Columbia-0 (Col-0) est illustrée à la figure 3. Dans des conditions de contrôle (milieu MS supplémenté en DMSO), la courbe de biosynthèse de la chlorophylle commence par une première poussée de la synthèse de la chlorophylle, dans laquelle le pool de protochlorphyllides synthétisé pendant la phase scotomorphogénique.......
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Discussion
Étapes critiques du protocole et du dépannage - pas de lumière et prendre soin du masque
Comme le souligne directement la description du protocole ci-dessus, il est d’une importance cruciale d’éviter même les traces de lumière pendant la culture des semis de plantes étiolées ou juste avant de commencer le protocole11. Dans notre installation, nous utilisons une chambre noire dédiée située dans le phytotron et séparée du reste du phytotron par une porte rotative étanche à la lum.......
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Déclarations de divulgation
Z.B. et K.P. sont des employés du PSI et Martin Trtilek est PDG et propriétaire de la société PSI produisant l’iReenCAM. Tous ces auteurs ont participé à l’élaboration de l’instrument tel que décrit précédemment7.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par le Fonds européen de développement régional-Projet SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Ce projet a reçu un financement dans le cadre du projet MSCA4Ukraine (ID 1233580), qui est financé par l’Union européenne. Nous remercions Lenka Sochurkova pour la conception graphique de la figure 1.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
| Feuille d’aluminium | Merck | Z691577 | |
| Arabidopsis thaliana Col-0 grainescollection | NASC | N1092 | |
| Chambre de culture | PSI | sur mesure | |
| Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
| Eppendorf monocanal, variable (100-1000 &mu ; L) | Merck | EP3123000063 | |
| Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
| Dispositif iReenCAM | PSI | sur mesure/prototype | |
| Flacons de laboratoire, avec bouchons (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
| Boîte à flux laminaire | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
| Ruban d’épissure en caoutchouc sans doublure, largeur 19 mm, noir, Scotch | 3M Science. Appliqué à la vie | 7000006085 | |
| Tube de microcentrifugation, 2 mL avec couvercle, PPT, MARQUE | Merck | BR780546-500EA | |
| Ruban microporeux | 3M Science. Appliqué à Life | 7100225115 | |
| Osram lumilux vert l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
| Plaques de Petri - Plats Greiner, carrés, 120 x 120 x17mm, ventilés | Merck | Z617679-240EA | |
| Pointes de pipette, 1000 &mu ; L, Axygen, | Merck | AXYT1000B | |
| Le logiciel d’analyse de données Plant Screen | PSI | livré dans le cadre de l’iReenCAM |
Références
- Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147(2012).
- Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis--the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
- Heyes....
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