Les organoïdes dérivés de patients gastriques sont de plus en plus utilisés dans la recherche, mais il n’existe pas de protocoles formels pour générer des organoïdes gastriques humains à partir de digestats unicellulaires avec une densité d’ensemencement standardisée. Ce protocole présente une méthode détaillée pour créer de manière fiable des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie obtenus lors de l’endoscopie haute.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Etablissement et caractérisation d’organoïdes gastriques dérivés de patients à partir de biopsies d’épithélium gastrique bénin et d’épithélium antral
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les organoïdes gastriques dérivés de patients (PDO) offrent un outil unique pour l’étude de la biologie et de la pathologie gastriques. Par conséquent, ces PDO sont de plus en plus utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Cependant, il existe une pénurie d’approches publiées pour produire des AOP gastriques à partir de digestats unicellulaires tout en maintenant une densité d’ensemencement cellulaire initiale standardisée. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’initiation d’organoïdes gastriques à partir de cellules isolées et sur la mise au point d’une méthode de transmission d’organoïdes par fragmentation. Il est important de noter que le protocole démontre qu’une approche standardisée de la densité d’ensemencement cellulaire initiale permet d’obtenir systématiquement des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie bénins et permet une quantification standardisée de la croissance des organoïdes. Enfin, les preuves soutiennent la nouvelle observation selon laquelle les AOP gastriques présentent des taux de formation et de croissance variables selon que les organoïdes proviennent de biopsies du corps ou de régions antrales de l’estomac. Plus précisément, il est révélé que l’utilisation de tissu de biopsie antrale pour l’initiation des organoïdes entraîne la formation d’un plus grand nombre d’organoïdes et une croissance plus rapide des organoïdes sur une période de 20 jours par rapport aux organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique. Le protocole décrit dans le présent document offre aux chercheurs une méthode opportune et reproductible pour générer et travailler avec succès des AOP gastriques.
Introduction
Les organoïdes sont des structures cellulaires tridimensionnelles miniatures (3D) qui ressemblent à l’architecture et à la fonctionnalité des organes dont ils sont issus 1,2. Ces modèles cultivés en laboratoire sont créés en cultivant des cellules souches ou des cellules tissulaires spécifiques dans un environnement contrôlé qui permet à ces cellules de s’auto-organiser et de se différencier en différents types cellulaires 1,2,3. L’un des principaux avantages des organoïdes est leur capacité à récapituler la biologie humaine de plus près que les cultures cellulaires bidimensionnelles (2D) traditionnelles 1,2,3. En particulier, il a été démontré que les organoïdes humains maintiennent la diversité génétique de leurs tissus d’origine 3,4,5. Les organoïdes offrent une occasion unique d’étudier le développement des organes humains, de modéliser des maladies et de tester des thérapies potentielles dans un environnement de laboratoire contrôlé. De plus, les organoïdes peuvent être dérivés d’échantillons individuels de patients, ce qui permet des approches de médecine personnalisée et le développement potentiel de traitements individualisés 3,6,7.
Les chercheurs ont utilisé des organoïdes gastriques humains pour étudier divers aspects de la biologie et de la pathologie gastriques. Parmi les exemples les plus frappants, citons l’utilisation d’organoïdes dérivés du patient (PDO) pour prédire les réponses à la chimiothérapie du cancer gastrique 8,9,10 et modéliser la réponse épithéliale à l’infection à Helicobacter pylori 11,12,13. Les organoïdes gastriques humains sont constitués de divers types de cellules présentes dans l’estomac, notamment les cellules du cou, les cellules de la fosse et d’autres cellules de soutien11,14. Les organoïdes gastriques peuvent être générés soit à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi), soit à partir de cellules souches directement isolées à partir de tissus gastriques obtenus par biopsies ou à partir d’échantillons de résection gastrique11,14. L’isolement des cellules souches gastriques du tissu gastrique se fait généralement en isolant et en cultivant des glandes gastriques ou en digérant enzymatiquement des échantillons de tissus pour libérer des cellules individuelles 9,13,15. Il est important de noter que la différenciation des cellules au sein des organoïdes gastriques générés à l’aide de l’une ou l’autre de ces techniques s’est avérée similaire13. Le protocole décrit ici se concentre sur un condensé unicellulaire.
Les organoïdes représentent une innovation scientifique qui comble le fossé entre la culture cellulaire traditionnelle et les organes entiers. Alors que la recherche dans le domaine continue de progresser, les organoïdes sont sur le point de contribuer au développement de traitements et de thérapies plus efficaces pour un large éventail d’applications. Compte tenu de l’utilisation croissante des AOP gastriques, il est nécessaire d’adopter une approche standardisée de leur génération. Ici, le protocole de génération de PDO gastriques humaines à partir de cellules uniques isolées à partir de tissus de biopsie gastrique bénigne acquis lors de l’endoscopie haute est décrit. Il est important de noter qu’un nombre normalisé de cellules individuelles est déterminé pour l’ensemencement afin de générer de manière fiable des AOP gastriques et de permettre une caractérisation ultérieure. À l’aide de cette technique, des différences fiables dans la formation et la croissance des organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique ou de l’antre gastrique sont démontrées.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Tous les tissus humains utilisés dans ce protocole ont été prélevés auprès de personnes qui ont donné leur consentement éclairé pour le prélèvement de tissus dans le cadre d’une étude de collecte de tissus gastriques approuvée par le Institutional Review Board de l’Université de Pennsylvanie (IRB #842961). Les participants à cette étude devaient subir une endoscopie haute dans le cadre de leurs soins de routine, être âgés d’au moins 18 ans et être en mesure de donner un consentement éclairé. Toutes les recherches menées ont respecté les directives établies par l’Université de Pennsylvanie.
1. Préparation expérimentale
- Préparez le support L-WRN conditionné comme décrit précédemment16. Bien que cela ne soit pas obligatoire, les concentrations de Wnt-3A, de R-spondine et de caboche contenues dans le milieu conditionné peuvent être vérifiées à l’aide d’une trousse ELISA disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
- Préparer les antibiotiques RPMI (RPMI-ABX), PBS-ANTIBIOTIQUES (PBS-ABX), PBS-Dithiothreitol (PBS-DTT), le tampon de digestion et les milieux organoïdes gastriques (voir le tableau supplémentaire 1 pour la composition détaillée). Le milieu organoïde gastrique est stable pendant 1 semaine à 4 °C.
- Pince autoclave, ciseaux à dissection fine et tubes de 1,5 ml.
- Commencez à décongeler la matrice de la membrane basale (Matrigel) sur de la glace.
- Commencez à décongeler le tampon de digestion et la trypsine-EDTA dans un bain-marie à 37 °C.
- Réglez un agitateur orbital d’incubateur à 37 °C et 200 tr/min.
2. Isolement des cellules individuelles du tissu de biopsie
- Prélever des biopsies gastriques lors d’une endoscopie haute17 en suivant le protocole clinique de l’établissement, impliquant probablement l’utilisation de pinces géantes. À l’aide d’une aiguille à bout émoussé, prélever des échantillons de tissus de la pince et les placer dans un tube conique de 15 ml contenant le milieu RPMI-ABX. Gardez le tube sur de la glace pour un transfert rapide au laboratoire.
REMARQUE : Au minimum, 2 à 4 biopsies doivent être prélevées. - Laissez le tissu de biopsie se déposer au fond du tube conique. À l’aide d’une pipette, aspirer le milieu et laver les biopsies deux fois avec 1 mL de tampon PBS-ABX. Il n’y a pas besoin de centrifugation, car les morceaux de tissu se déposent naturellement dans le tube conique.
- Transférez un minimum de 20 mg de tissu de biopsie dans un tube de 1,5 mL contenant 1 mL de PBS-DTT.
- Utilisez des ciseaux de dissection fins pour couper le tissu en morceaux de 1 à 2 mm ou moins.
- Utilisez une minicentrifugeuse de table pendant 15 s pour agréger les morceaux de tissu au fond du tube et aspirer autant de surnageant que possible. Un petit volume résiduel de PBS-TNT est acceptable.
- Ajouter 5 mL de tampon de digestion fraîchement réchauffé dans un tube conique de 50 mL. Pour transférer les petits morceaux de tissu sans perdre de tissu, prélevez 500 μL du tampon de digestion et ajoutez-le dans le tube de 1,5 mL contenant le tissu. Ensuite, modifiez l’embout d’un embout de pipette de 1000 μL avec des ciseaux pour augmenter le diamètre de l’embout, ce qui permet d’aspirer et de transférer facilement les morceaux de tissu dans le tube conique de 50 mL contenant le tampon de digestion.
- Incuber le tampon de digestion et le mélange tissulaire à 37 °C pendant 30 min avec agitation orbitale à 200 tr/min.
- Ajouter 5 mL de trypsine réchauffée avec 0,25 % d’EDTA dans le tampon de digestion et incuber pendant 10 min supplémentaires à 37 °C avec agitation orbitale à 200 tr/min.
- Neutraliser le tampon de digestion et la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu Advanced (Adv.) DMEM/F12 et faire passer la solution à travers une passoire cellulaire de 70 μm.
- Granuler les cellules par centrifugation à 1400 x g pendant 4 min à 4 °C. Selon la taille initiale du tissu de biopsie, une pastille à petites cellules peut être visible ou non.
- Remettre la pastille cellulaire en suspension dans 1 mL de milieu Adv. DMEM/F12 et compter le nombre de cellules viables à l’aide de Trypan Blue et d’un hémocytomètre.
- Pulvériser à nouveau les cellules par centrifugation à 1400 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant.
REMARQUE : La figure 1 présente une représentation schématique du processus d’isolement des cellules individuelles du tissu de biopsie.
3. Intégration de cellules individuelles dans un « dôme » de matrice de membrane basale
- En fonction du nombre compté de cellules viables, calculer le volume de matrice de membrane basale nécessaire pour atteindre une concentration finale de 10à 5 cellules viables par 50 μL de matrice de membrane basale.
- Effectuez rapidement les opérations suivantes pour éviter que la matrice de la membrane basale ne polymérise avant le placage. Retirez la matrice de la membrane basale décongelée de la glace, ajoutez le volume de matrice de la membrane basale précédemment calculé dans les cellules et mélangez doucement en pipetant de haut en bas pendant environ 10 s.
REMARQUE : Il est crucial d’éviter de créer des bulles lors de cette étape. Ne pas diluer la matrice de la membrane basale. - Pipeter rapidement 50 μL d’aliquotes du mélange matrice membranaire/cellule de la membrane basale au centre des puits individuels dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits.
- Couvrez immédiatement la plaque à 24 puits et, d’un seul mouvement fluide, retournez la plaque à l’envers. Placez la plaque inversée dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 35 min pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser.
REMARQUE : L’inversion de la plaque est essentielle pour empêcher les cellules de couler au fond de la plaque et pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser en une forme de « dôme » 3D. - Ajouter 500 μL de milieu organoïde gastrique préchauffé dans chaque puits, en veillant à ce que le haut de chaque « dôme » soit complètement immergé dans le milieu. Distribuez le média sur le côté de chaque puits pour éviter de perturber le « dôme ».
- Changez le support tous les 2-3 jours.
4. Passage de routine d’organoïdes par fragmentation
- Une fois que les organoïdes sont prêts à être transportés, retirez le milieu de chaque puits désigné.
REMARQUE : Pour déterminer le moment approprié pour le passage, veuillez vous référer à la section Résultats représentatifs. - Distribuez 1 mL de média Adv. DMEM/F12 glacé directement sur un « dôme » de matrice membranaire basale. Cela devrait facilement initier la rupture du « dôme ». Continuez à aspirer et à distribuer jusqu’à ce que tous les fragments du « dôme » se détachent de la plaque.
- Transporter à la fois le milieu et la matrice de la membrane basale fragmentée vers le puits suivant, en répétant ce processus pour tous les puits destinés au passage. Après avoir désassemblé le « dôme » final de la matrice de la membrane basale, distribuer le milieu et le mélange d’organoïdes et de matrice de la membrane basale dans un tube de 1,5 ml.
- Fixez un embout de 1000 μL à une pipette P1000, puis insérez cet embout dans un embout de 200 μL. Cela permettra de créer une pointe de pipette d’un diamètre suffisamment petit pour fragmenter les organoïdes tout en permettant l’aspiration d’un volume plus important.
- Pipeter vigoureusement le mélange d’organoïdes et de matrice de membrane basale de haut en bas environ 25 fois pour fragmenter les organoïdes en petits morceaux.
- Centrifuger le mélange organoïde fragmenté à l’aide d’une centrifugeuse de table à 4 °C pendant 30 s à 2000 x g. Il en résultera une pastille d’organoïdes fragmentés séparés de la matrice et du milieu de la membrane basale. À l’aide d’une pipette, aspirer le milieu et le surnageant de la matrice de la membrane basale. N’utilisez pas d’aspirateur pour aspirer le surnageant, car la pastille est lâche.
- Calculer le volume de matrice de membrane basale fraîchement décongelée nécessaire pour que le nombre de puits/dômes soit divisé dans un rapport de 1 :2 (50 μL/dôme). Ajoutez la matrice de la membrane basale fraîche et pipetez doucement de haut en bas pour mélanger, en prenant soin d’éviter de créer des bulles.
- Aliquote rapidement 50 μL du mélange de fragments organoïdes et de matrice de membrane basale dans des puits individuels d’une plaque à 24 puits.
- Couvrez la plaque, retournez-la et placez-la dans un incubateur de culture tissulaire à 37 °C pendant 35 min pour permettre à la matrice de la membrane basale de polymériser.
- Ajouter 500 μL de milieux organoïdes gastriques préchauffés dans chaque puits.
NOTE : La figure 2 présente un aperçu schématique du passage des organoïdes dérivés de patients gastriques par fragmentation.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Les résultats représentatifs ultérieurs sont dérivés de biopsies prélevées sur l’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre gastrique de l’estomac de cinq patients différents subissant une endoscopie haute. Deux à quatre « dômes » / puits ont été plaqués et analysés par patient pour les biopsies du corps gastrique et de l’antre. Des organoïdes ont été générés avec succès à partir du corps gastrique et du tissu de biopsie de l’antre gastrique des cinq patients. En moyenne, 41 organoïdes ont été analysés par « dôme ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Dans ce document, un protocole détaillé pour générer de manière fiable des organoïdes gastriques humains à partir de cellules uniques isolées à partir de biopsies d’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre est décrit. Les étapes critiques du protocole tournent autour de la synchronisation ainsi que de la manipulation de la matrice de la membrane basale. Pour préserver la viabilité, il est essentiel d’initier le protocole le plus tôt possible après l’acquisition du tissu de biopsie. L’objectif est de commencer à ...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas de divulgations pertinentes.
Remerciements
Médecine génomique de l’Université de Pennsylvanie T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), programme Men & BRCA au Basser Center for BRCA (KHB, BWK), bourse de la Fondation de la famille DeGregorio (BWK).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,25 % Trypsine-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R& D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotéricine B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicine | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplément | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R& D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a Kit ELISA | R& D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
Références
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359(2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255(2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819(2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519(2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151(2023).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
