Etablissement et caractérisation d’organoïdes gastriques dérivés de patients à partir de biopsies d’épithélium gastrique bénin et d’épithélium antral

Résumé

Les organoïdes dérivés de patients gastriques sont de plus en plus utilisés dans la recherche, mais il n’existe pas de protocoles formels pour générer des organoïdes gastriques humains à partir de digestats unicellulaires avec une densité d’ensemencement standardisée. Ce protocole présente une méthode détaillée pour créer de manière fiable des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie obtenus lors de l’endoscopie haute.

Résumé

Les organoïdes gastriques dérivés de patients (PDO) offrent un outil unique pour l’étude de la biologie et de la pathologie gastriques. Par conséquent, ces PDO sont de plus en plus utilisés dans un large éventail d’applications de recherche. Cependant, il existe une pénurie d’approches publiées pour produire des AOP gastriques à partir de digestats unicellulaires tout en maintenant une densité d’ensemencement cellulaire initiale standardisée. Dans ce protocole, l’accent est mis sur l’initiation d’organoïdes gastriques à partir de cellules isolées et sur la mise au point d’une méthode de transmission d’organoïdes par fragmentation. Il est important de noter que le protocole démontre qu’une approche standardisée de la densité d’ensemencement cellulaire initiale permet d’obtenir systématiquement des organoïdes gastriques à partir de tissus de biopsie bénins et permet une quantification standardisée de la croissance des organoïdes. Enfin, les preuves soutiennent la nouvelle observation selon laquelle les AOP gastriques présentent des taux de formation et de croissance variables selon que les organoïdes proviennent de biopsies du corps ou de régions antrales de l’estomac. Plus précisément, il est révélé que l’utilisation de tissu de biopsie antrale pour l’initiation des organoïdes entraîne la formation d’un plus grand nombre d’organoïdes et une croissance plus rapide des organoïdes sur une période de 20 jours par rapport aux organoïdes générés à partir de biopsies du corps gastrique. Le protocole décrit dans le présent document offre aux chercheurs une méthode opportune et reproductible pour générer et travailler avec succès des AOP gastriques.

Introduction

Les organoïdes sont des structures cellulaires tridimensionnelles miniatures (3D) qui ressemblent à l’architecture et à la fonctionnalité des organes dont ils sont issus ^1,2. Ces modèles cultivés en laboratoire sont créés en cultivant des cellules souches ou des cellules tissulaires spécifiques dans un environnement contrôlé qui permet à ces cellules de s’auto-organiser et de se différencier en différents types cellulaires ^1,2,3. L’un des principaux avantages des organoïdes est leur capacité à récapituler la biologie ....

Protocole

Tous les tissus humains utilisés dans ce protocole ont été prélevés auprès de personnes qui ont donné leur consentement éclairé pour le prélèvement de tissus dans le cadre d’une étude de collecte de tissus gastriques approuvée par le Institutional Review Board de l’Université de Pennsylvanie (IRB #842961). Les participants à cette étude devaient subir une endoscopie haute dans le cadre de leurs soins de routine, être âgés d’au moins 18 ans et être en mesure de donner un consentement éclairé. Toutes les recherches menées ont respecté les directives établies par l’Université de Pennsylvanie.

1. Préparation expérimentale

Résultats

Les résultats représentatifs ultérieurs sont dérivés de biopsies prélevées sur l’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre gastrique de l’estomac de cinq patients différents subissant une endoscopie haute. Deux à quatre « dômes » / puits ont été plaqués et analysés par patient pour les biopsies du corps gastrique et de l’antre. Des organoïdes ont été générés avec succès à partir du corps gastrique et du tissu de biopsie de l’antre gastrique des cinq patients. En moyenne, 41 organoïdes ont été analysés par « dôme .......

Discussion

Dans ce document, un protocole détaillé pour générer de manière fiable des organoïdes gastriques humains à partir de cellules uniques isolées à partir de biopsies d’épithélium bénin du corps gastrique et de l’antre est décrit. Les étapes critiques du protocole tournent autour de la synchronisation ainsi que de la manipulation de la matrice de la membrane basale. Pour préserver la viabilité, il est essentiel d’initier le protocole le plus tôt possible après l’acquisition du tissu de biopsie. L’objectif est de commencer à .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % Trypsine-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R& D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotéricine B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicine	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplément	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R& D Systems	DY4120-05
Wnt-3a Kit ELISA	R& D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503