良性胃体和胃窦上皮活检患者来源的胃类器官的建立和表征
Summary
胃患者来源的类器官在研究中得到了越来越多的应用，但缺乏从具有标准化接种密度的单细胞消化物中生成人胃类器官的正式方案。该协议提出了一种从上消化道内窥镜检查期间获得的活检组织可靠地创建胃类器官的详细方法。
Abstract
胃患者来源的类器官 （PDO） 为研究胃生物学和病理学提供了一种独特的工具。因此，这些 PDO 在广泛的研究应用中得到越来越多的应用。然而，在保持标准化初始细胞接种密度的同时，从单细胞消化物中生产胃 PDO 的已发表方法存在短缺。在该协议中，重点是从分离的单细胞中启动胃类器官，并提供一种通过片段传代类器官的方法。重要的是，该方案表明，初始细胞接种密度的标准化方法始终如一地从良性活检组织中产生胃类器官，并允许类器官生长的标准化定量。最后，证据支持新的观察结果，即胃PDOs显示出不同的形成和生长速率，这取决于类器官是来自身体的活检还是胃的窦区。具体来说，与胃体活检产生的类器官相比，使用窦活检组织进行类器官启动会导致在 20 天内形成更多的类器官和更快的类器官生长。本文描述的方案为研究人员提供了一种及时且可重复的方法，用于成功生成和使用胃 PDO。
Introduction
类器官是微型三维 （3D） 细胞结构，类似于它们衍生的器官的结构和功能 1,2。这些实验室培养的模型是通过在受控环境中培养干细胞或组织特异性细胞而创建的，该环境允许这些细胞自组织并分化成各种细胞类型1,2,3。类器官的主要优势之一是它们能够比传统的二维 （2D） 细胞培养物更接近地概括人类生物学 1,2,3。特别是，人类类器官已被证明可以维持其起源组织的遗传多样性3,4,5。类器官提供了一个独特的机会，可以在受控的实验室环境中研究人体器官发育、模拟疾病和测试潜在的治疗方法。此外，类器官可以从个体患者样本中衍生出来，从而实现个性化医疗方法和个性化治疗的潜在发展3,6,7。
研究人员使用人类胃类器官来研究胃生物学和病理学的各个方面。突出的例子包括使用患者来源的类器官 （PDO） 来预测胃癌化疗反应 8,9,10 和模拟对幽门螺杆菌感染的上皮反应 11,12,13。人胃类器官由胃中发现的各种细胞类型组成，包括颈部细胞、凹陷细胞和其他支持细胞11,14。胃类器官可以由诱导多能干细胞（iPSCs）产生，也可以从通过活检获得的胃组织或胃切除标本中直接分离的干细胞产生11,14。从胃组织中分离胃干细胞通常通过分离和培养胃腺或酶消化组织样本以释放单个细胞来完成 9,13,15。重要的是，使用这些技术中的任何一种产生的胃类器官内细胞的分化已被证明是相似的13。本文描述的方案侧重于单细胞消化物。
类器官代表了一种科学创新，它弥合了传统细胞培养和整个器官之间的差距。随着该领域研究的不断进展，类器官有望为开发更有效的治疗方法和疗法做出贡献，以实现广泛的应用。鉴于胃PDO的使用率不断提高，及时需要一种标准化的方法来产生它们。在这里，描述了从上消化道内窥镜检查期间获得的良性胃活检组织中分离的单个细胞中产生人胃PDO的方案。重要且独特的是，确定标准化数量的单细胞进行接种，以可靠地产生胃PDO并允许随后的表征。使用这种技术，证明了胃体或胃窦活检产生的类器官形成和生长的可靠差异。
Protocol
Representative Results
Discussion
本文概述了从胃体和胃窦的良性上皮活检中分离出的单细胞可靠地产生人胃类器官的详细方案。该协议中的关键步骤围绕着定时以及处理基底膜基质。为了保持活力，必须在获得活检组织后尽快启动方案。目的是在进行活检后 30 分钟内开始消化活检组织。处理基底膜基质也可能具有挑战性。在冰上解冻时，它仍然是液体;然而，在高于4°C的温度下，它会聚合。因此，必须立即将基底膜基质从冰中?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
宾夕法尼亚大学基因组医学T32 HG009495（KHB），NCI R21 CA267949（BWK），Basser BRCA中心的男性和BRCA项目（KHB，BWK），DeGregorio家庭基金会资助奖（BWK）。
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
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