הקמה ואפיון של אורגנואידי קיבה שמקורם במטופל מביופסיות של גוף קיבה שפיר ואפיתל אנטראלי
Summary
אורגנואידים שמקורם בקיבה מוצאים שימוש הולך וגובר במחקר, אך פרוטוקולים רשמיים ליצירת אורגנואידי קיבה אנושיים מתעכלים חד-תאיים עם צפיפות זריעה מתוקננת חסרים. פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת ליצירת אורגנואידים בקיבה באופן אמין מרקמת ביופסיה המתקבלת במהלך אנדוסקופיה עליונה.
Abstract
אורגנואידים שמקורם בקיבה (PDOs) מציעים כלי ייחודי לחקר ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. כתוצאה מכך, PDOs אלה מוצאים שימוש הולך וגובר במגוון רחב של יישומי מחקר. עם זאת, קיים מחסור בגישות שפורסמו לייצור PDO בקיבה מתעכלים חד-תאיים תוך שמירה על צפיפות זריעת תאים ראשונית מתוקננת. בפרוטוקול זה, הדגש הוא על התחלת אורגנואידים בקיבה מתאים בודדים מבודדים ומתן שיטה להעברת אורגנואידים באמצעות פיצול. חשוב לציין, הפרוטוקול מראה כי גישה סטנדרטית לצפיפות זריעת התאים הראשונית מניבה באופן עקבי אורגנואידים בקיבה מרקמת ביופסיה שפירה ומאפשרת כימות סטנדרטי של צמיחת אורגנואידים. לבסוף, ראיות תומכות בתצפית החדשנית כי PDO קיבה מציג שיעורים משתנים של היווצרות וגדילה בהתבסס על האם מקורם של האורגנואידים בביופסיות של הגוף או באזורים אנטראליים של הקיבה. באופן ספציפי, מתגלה כי השימוש ברקמת ביופסיה אנטראלית להתחלת אורגנואידים גורם למספר גדול יותר של אורגנואידים שנוצרו ולצמיחת אורגנואידים מהירה יותר על פני תקופה של 20 יום בהשוואה לאורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה. הפרוטוקול המתואר כאן מציע לחוקרים שיטה בזמן וניתנת לשחזור ליצירה מוצלחת ולעבודה עם PDO קיבה.
Introduction
אורגנואידים הם מבנים תאיים זעירים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) הדומים לארכיטקטורה ולפונקציונליות של האיברים שמהם הם נגזרו 1,2. מודלים אלה שגודלו במעבדה נוצרים על ידי טיפוח תאי גזע או תאים ספציפיים לרקמות בסביבה מבוקרת המאפשרת לתאים אלה להתארגן בעצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים 1,2,3. אחד היתרונות העיקריים של אורגנואידים הוא יכולתם לשחזר את הביולוגיה האנושית באופן הדוק יותר מאשר תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות (2D) 1,2,3. בפרט, אורגנואידים אנושיים הוכחו לשמור על המגוון הגנטי של רקמת המקור שלהם 3,4,5. אורגנואידים מציעים הזדמנות ייחודית לחקור התפתחות איברים אנושיים, למדל מחלות ולבחון טיפולים פוטנציאליים בסביבת מעבדה מבוקרת. יתר על כן, ניתן להפיק אורגנואידים מדגימות בודדות של מטופלים, מה שמאפשר גישות של רפואה מותאמת אישית ופיתוח פוטנציאלי של טיפולים מותאמים אישית 3,6,7.
חוקרים השתמשו באורגנואידים של קיבה אנושית כדי לחקור היבטים שונים של ביולוגיה ופתולוגיה של קיבה. דוגמאות בולטות כוללות את השימוש באורגנואידים שמקורם בחולים (PDOs) כדי לחזות תגובות כימותרפיותלסרטן קיבה 8,9,10 ולדגמן את תגובת האפיתל לזיהום הליקובקטר פילורי 11,12,13. אורגנואידי קיבה אנושיים מורכבים מסוגי תאים שונים הנמצאים בקיבה, כולל תאי צוואר, תאי בור ותאים תומכים אחרים11,14. אורגנואידים בקיבה יכולים להיווצר מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) או מתאי גזע שבודדו ישירות מרקמת קיבה המתקבלת באמצעות ביופסיות או מדגימות כריתת קיבה11,14. בידוד תאי גזע בקיבה מרקמת קיבה נעשה בדרך כלל על ידי בידוד ותרבית בלוטות קיבה או עיכול אנזימטי של דגימות רקמה כדי לשחרר תאים בודדים 9,13,15. חשוב לציין, ההתמיינות של תאים בתוך אורגנואידים קיבה שנוצרו באמצעות כל אחת מהטכניקות הללו הוכחה כדומה13. הפרוטוקול המתואר כאן מתמקד בתקציר חד-תאי.
אורגנואידים מייצגים חידוש מדעי המגשר על הפער בין תרבית תאים מסורתית לבין איברים שלמים. ככל שהמחקר בתחום ממשיך להתקדם, אורגנואידים צפויים לתרום לפיתוח טיפולים וטיפולים יעילים יותר למגוון רחב של יישומים. בהתחשב בשימוש הגובר של PDO קיבה, יש צורך בזמן גישה סטנדרטית הדור שלהם. כאן מתואר הפרוטוקול ליצירת PDO קיבה אנושי מתאים בודדים שבודדו מרקמת ביופסיית קיבה שפירה שנרכשה במהלך אנדוסקופיה עליונה. חשוב וייחודי, נקבע מספר סטנדרטי של תאים בודדים לזריעה כדי ליצור באופן אמין PDO קיבה ולאפשר אפיון לאחר מכן. באמצעות טכניקה זו, הבדלים אמינים בהיווצרות וצמיחה של אורגנואידים שנוצרו מביופסיות של גוף הקיבה או אנטרום קיבה מודגמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
להלן מתואר פרוטוקול מפורט ליצירה אמינה של אורגנואידי קיבה אנושיים מתאים בודדים שבודדו מביופסיות של אפיתל שפיר מגוף הקיבה והאנטרום. השלבים הקריטיים בפרוטוקול סובבים סביב תזמון, כמו גם טיפול במטריצת קרום המרתף. כדי לשמר את הכדאיות, חיוני להתחיל את הפרוטוקול בהקדם האפשרי לאחר רכישת רקמת הב?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אוניברסיטת פנסילבניה רפואה גנומית T32 HG009495 (KHB), NCI R21 CA267949 (BWK), גברים ותוכנית BRCA במרכז בסר ל- BRCA (KHB, BWK), פרס מענק קרן משפחת גרגוריו (BWK).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| A83-01 | R&D Systems | 2939 | |
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Amphotericin B | Invitrogen | 15290018 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| BZ-X710 | Keyence | n/a | |
| cellSens | Olympus | n/a | |
| Collagenase III | Worthington | LS004182 | |
| Dispase II | Sigma | D4693-1G | |
| Dithiothreitol (DTT) | EMSCO/Fisher | BP1725 | |
| DPBS | Gibco | 14200-075 | |
| Fungin | InvivoGen | NC9326704 | |
| Gastrin I | Sigma Aldrich | G9145 | |
| Gentamicin | Invitrogen | 1570060 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | |
| hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| HEPES | Invitrogen | 15630080 | |
| hFGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| Matrigel | Corning | 47743-715 | |
| Metronidazole | MP Biomedicals | 155710 | |
| N2 Supplement | Invitrogen | 17502048 | |
| Noggin ELISA Kit | Novus Biologicals | NBP2-80296 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-085 | |
| R-Spondin ELISA Kit | R&D Systems | DY4120-05 | |
| Wnt-3a ELISA Kit | R&D Systems | DY1324B-05 | |
| Y-27632 | Sigma Aldrich | Y0503 |
References
- Drost, J., Clevers, H. Organoids in cancer research. Nature Reviews Cancer. 18 (7), 407-418 (2018).
- Corrò, C., Novellasdemunt, L., Li, V. S. A brief history of organoids. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 319 (1), C151-C165 (2020).
- Zhao, Z., et al. Organoids. Nature Reviews Methods Primers. 2 (1), 94 (2022).
- Weeber, F., et al. Preserved genetic diversity in organoids cultured from biopsies of human colorectal cancer metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), 13308-13311 (2015).
- Boretto, M., et al. Patient-derived organoids from endometrial disease capture clinical heterogeneity and are amenable to drug screening. Nature Cell Biology. 21 (8), 1041-1051 (2019).
- Lo, Y. H., Karlsson, K., Kuo, C. J. Applications of organoids for cancer biology and precision medicine. Nature Cancer. 1 (8), 761-773 (2020).
- Grönholm, M., et al. Patient-derived organoids for precision cancer immunotherapy. Cancer research. 81 (12), 3149-3155 (2021).
- Yan, H. H., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Yoon, C., et al. Patient-derived organoids from locally advanced gastric adenocarcinomas can predict resistance to neoadjuvant chemotherapy. Journal of Gastrointestinal Surgery. 27 (4), 666-676 (2023).
- Miao, X., et al. Establishment of gastric cancer organoid and its application in individualized therapy. Oncology Letters. 24 (6), 1-8 (2022).
- Pompaiah, M., Bartfeld, S. Gastric organoids: an emerging model system to study Helicobacter pylori pathogenesis. Molecular Pathogenesis and Signal Transduction by Helicobacter pylori. 400, 149-168 (2017).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Seidlitz, T., Koo, B. K., Stange, D. E. Gastric organoids-an in vitro model system for the study of gastric development and road to personalized medicine. Cell Death & Differentiation. 28 (1), 68-83 (2021).
- Bartfeld, S., Clevers, H. Organoids as model for infectious diseases: culture of human and murine stomach organoids and microinjection of Helicobacter pylori. Journal of Visualized Experiments. 105, e53359 (2015).
- Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture. Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).
- Yang, H. J., et al. Sample collection methods in upper gastrointestinal research. Journal of Korean Medical Science. 38 (32), e255 (2023).
- Kim, S., et al. Comparison of cell and organoid-level analysis of patient-derived 3D organoids to evaluate tumor cell growth dynamics and drug response. SLAS DISCOVERY: Advancing the Science of Drug Discovery. 25 (7), 744-754 (2020).
- Maru, Y., Tanaka, N., Itami, M., Hippo, Y. Efficient use of patient-derived organoids as a preclinical model for gynecologic tumors. Gynecologic Oncology. 154 (1), 189-198 (2019).
- McGowan, K. P., Delgado, E., Hibdon, E. S., Samuelson, L. C. Differential sensitivity to Wnt signaling gradients in human gastric organoids derived from corpus and antrum. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 325 (2), G158-G173 (2023).
- Busslinger, G. A., et al. Human gastrointestinal epithelia of the esophagus, stomach, and duodenum resolved at single-cell resolution. Cell Reports. 34 (10), 108819 (2021).
- Yang, R., et al. A quick and reliable image-based AI algorithm for evaluating cellular senescence of gastric organoids. Cancer Biology & Medicine. 20 (7), 519 (2023).
- Skubleny, D., et al. Murine and Human gastric tissue establishes organoids after 48 hours of cold ischemia time during shipment. Biomedicines. 11 (1), 151 (2023).
