Etablering og karakterisering av pasientavledede gastriske organoider fra biopsier av godartet magelegeme og antralepitel

Summary

Gastrisk pasientavledede organoider finner økende bruk i forskning, men formelle protokoller for generering av humane gastriske organoider fra enkeltcellefordøyelser med standardisert såtetthet mangler. Denne protokollen presenterer en detaljert metode for pålitelig å lage mageorganoider fra biopsivev oppnådd under øvre endoskopi.

Abstract

Gastrisk pasientavledede organoider (PUD) tilbyr et unikt verktøy for å studere gastrisk biologi og patologi. Disse PUD-ene blir derfor stadig mer brukt i en lang rekke forskningsapplikasjoner. Imidlertid eksisterer det mangel på publiserte tilnærminger for å produsere gastriske PUDer fra enkeltcellefordøyelser samtidig som man opprettholder en standardisert innledende cellesåingstetthet. I denne protokollen legges det vekt på initiering av mageorganoider fra isolerte enkeltceller og tilveiebringelse av en metode for passering av organoider gjennom fragmentering. Det er viktig at protokollen viser at en standardisert tilnærming til den opprinnelige cellesåingstettheten konsekvent gir gastriske organoider fra godartet biopsivev og muliggjør standardisert kvantifisering av organoidvekst. Endelig støtter bevis den nye observasjonen at gastriske PUDer viser varierende dannelses- og veksthastigheter basert på om organoider stammer fra biopsier i kroppen eller antralområdene i magen. Spesielt er det avslørt at bruken av antralbiopsivev for organoid initiering resulterer i et større antall organoider dannet og raskere organoidvekst over en 20-dagers periode sammenlignet med organoider generert fra biopsier i magelegemet. Protokollen beskrevet her gir etterforskere en rettidig og reproduserbar metode for vellykket generering og arbeid med gastrisk PUD.

Introduction

Organoider er miniatyr tredimensjonale (3D) cellulære strukturer som ligner arkitekturen og funksjonaliteten til organene de ble avledet fra ^1,2. Disse lab-dyrkede modellene er opprettet ved å dyrke stamceller eller vevsspesifikke celler i et kontrollert miljø som gjør at disse cellene kan organisere seg selv og differensiere i forskjellige celletyper ^1,2,3. En av de viktigste fordelene med organoider er deres evne til å rekapitulere menneskelig biologi nærmere enn tradisjonelle todimensjonale (2D) cellekulturer ^1,2,3. Spesielt har menneskelige organoider vist seg å opprettholde det genetiske mangfoldet av deres opprinnelsesvev ^3,4,5. Organoider tilbyr en unik mulighet til å studere menneskelig organutvikling, modellsykdommer og teste potensielle terapier i en kontrollert laboratorieinnstilling. Videre kan organoider utledes fra individuelle pasientprøver, noe som muliggjør personlig medisintilnærming og potensiell utvikling av individualiserte behandlinger ^3,6,7.

Forskere har brukt humane gastriske organoider til å undersøke ulike aspekter av gastrisk biologi og patologi. Fremtredende eksempler inkluderer bruk av pasientavledede organoider (PUD) for å forutsi cellegiftrespons i magekreft ^8,9,10 og modellere epitelresponsen på Helicobacter pylori-infeksjon 11,12,13. Humane gastriske organoider består av forskjellige celletyper som finnes i magen, inkludert nakkeceller, pitceller og andre støttende celler^11,14. Gastrisk organoider kan enten genereres fra induserte pluripotente stamceller (iPSCs) eller stamceller direkte isolert fra magevev oppnådd via biopsier eller fra gastriske reseksjonsprøver^11,14. Isoleringen av magestamceller fra magevev gjøres vanligvis ved å isolere og dyrke magekjertler eller enzymatisk fordøye vevsprøver for å frigjøre enkeltceller ^9,13,15. Det er viktig at differensieringen av celler i gastrisk organoider generert ved hjelp av en av disse teknikkene har vist seg å være lik¹³. Protokollen beskrevet her fokuserer på en enkeltcellefordøye.

Organoider representerer en vitenskapelig innovasjon som bygger bro mellom tradisjonell cellekultur og hele organer. Etter hvert som forskningen på feltet fortsetter å utvikle seg, er organoider klare til å bidra til utvikling av mer effektive behandlinger og terapier for et bredt spekter av applikasjoner. Gitt den økende bruken av gastrisk PUD, er det et rettidig behov for en standardisert tilnærming til deres generasjon. Her beskrives protokollen for generering av humane gastriske PUDer fra enkeltceller isolert fra godartet gastrisk biopsivev oppnådd under øvre endoskopi. Viktig og unikt er et standardisert antall enkeltceller bestemt for såing for pålitelig å generere gastriske PUDer og tillate etterfølgende karakterisering. Ved hjelp av denne teknikken demonstreres pålitelige forskjeller i dannelsen og veksten av organoider generert fra biopsier av enten magelegemet eller magesekken.

Protocol

Alt menneskelig vev som ble brukt i denne protokollen ble samlet inn fra personer som ga informert samtykke til vevsinnsamling gjennom en magevevsinnsamlingsstudie godkjent av University of Pennsylvania Institutional Review Board (IRB # 842961). Deltakerne i denne studien måtte gjennomgå en øvre endoskopi som en del av deres rutinemessige omsorg, være minst 18 år og kunne gi informert samtykke. All forskning utført fulgte retningslinjene fastsatt av University of Pennsylvania. 1. E…

Representative Results

De påfølgende representative resultatene er avledet fra biopsier tatt fra det godartede epitelet av både magelegemet og mage-antrum-regionene i magen hos fem forskjellige pasienter som gjennomgår øvre endoskopi. To til fire “kupler”/brønner ble belagt og analysert per pasient for både magelegeme- og antrumbiopsier. Organoider ble vellykket generert fra magelegemet og gastrisk antrumbiopsivev fra alle fem pasientene. I gjennomsnitt ble 41 organoider analysert per “kuppel”/brønn. Alle bildene er z-projeksjoner erve…

Discussion

Her er en detaljert protokoll for pålitelig generering av humane gastriske organoider fra enkeltceller isolert fra biopsier av godartet epitel fra magelegemet og antrum skissert. Kritiske trinn i protokollen dreier seg om timing samt håndtering av kjellermembranmatrisen. For å bevare levedyktigheten er det viktig å starte protokollen så snart som mulig etter å ha anskaffet biopsivevet. Målet er å begynne å fordøye biopsivevet innen 30 minutter etter at biopsien er utført. Håndtering av kjellermembranmatrisen …

Materials

0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503