Quantifizierung der elastischen Eigenschaften von Umweltbiofilmen mittels optischer Kohärenzelastographie

Summary

Dieser Artikel hebt die Wirksamkeit der optischen Kohärenz-Elastographie (OCE) bei der schnellen und zerstörungsfreien Charakterisierung der elastischen Eigenschaften von Biofilmen hervor. Wir erläutern kritische OCE-Implementierungsverfahren für genaue Messungen und präsentieren Youngs Modulwerte für zwei granulare Biofilme.

Abstract

Biofilme sind komplexe Biomaterialien, die aus einem gut organisierten Netzwerk mikrobieller Zellen bestehen, die von selbst produzierten extrazellulären polymeren Substanzen (EPS) umhüllt sind. In diesem Artikel wird eine detaillierte Darstellung der Implementierung von optischen Kohärenzelastographie-Messungen (OCE) vorgestellt, die auf die elastische Charakterisierung von Biofilmen zugeschnitten sind. OCE ist ein zerstörungsfreies optisches Verfahren, das die lokale Abbildung der Mikrostruktur, Morphologie und viskoelastischen Eigenschaften von teiltransparenten weichen Materialien mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. Wir bieten einen umfassenden Leitfaden, der die wesentlichen Verfahren für die korrekte Implementierung dieser Technik beschreibt, zusammen mit einer Methodik zur Schätzung des Elastizitätsmoduls von granularen Biofilmen aus den gesammelten Messungen. Diese bestehen aus dem Systemaufbau, der Datenerfassung und der Nachbearbeitung. In der Diskussion tauchen wir in die zugrunde liegende Physik der in OCE verwendeten Sensoren ein und untersuchen die grundlegenden Einschränkungen hinsichtlich der räumlichen und zeitlichen Skalen von OCE-Messungen. Wir schließen mit möglichen zukünftigen Richtungen für die Weiterentwicklung der OCE-Technik, um elastische Messungen von Umweltbiofilmen zu erleichtern.

Introduction

In der Abwasserbehandlung und Wasserressourcenrückgewinnung werden zunehmend nützliche Biofilme in angeschlossenen Wachstumsreaktoren eingesetzt, um Mikroben in die Lage zu versetzen, unerwünschte Schadstoffe wie organische Stoffe, Stickstoff und Phosphat in stabilisierte Formen umzuwandeln, die leicht aus dem Wasser entfernt werden können¹. In diesen Systemen ist die emergente Funktion des Biofilms, nämlich biochemische Transformationen, eng mit der Vielfalt der darin lebenden Mikroben und den Nährstoffen, die diese Mikroben erhalten, verbunden². Dementsprechend kann das anhaltende Biofilmwachstum eine Herausforderung für die Aufrechterhaltung einer konsistenten Reaktorfunktionalität darstellen, da das neue Biofilmwachstum die gesamten Stoffwechselprozesse, die Stofftransfereigenschaften und die Zusammensetzung der Gemeinschaft des Biofilms verändern kann. Eine möglichst weitgehende Stabilisierung der Biofilmumgebung kann vor solchen Veränderungen schützen³. Dazu gehört, einen gleichmäßigen Nährstofffluss zu gewährleisten und die Struktur des Biofilms mit einer gleichmäßigen Dicke stabil^{zu halten 4}. Die Überwachung der Steifigkeit und der physikalischen Struktur des Biofilms würde es den Forschern ermöglichen, Einblicke in den allgemeinen Zustand und die Funktion des Biofilms zu gewinnen.

Biofilme weisen viskoelastische Eigenschaften^{auf 5,6,7}. Diese viskoelastische Natur führt zu einer Kombination aus einer momentanen und einer langsamen, zeitabhängigen Verformung als Reaktion auf äußere mechanische Kräfte. Eine Besonderheit von Biofilmen ist, dass sie bei starker Verformung wie zähflüssige Flüssigkeiten reagieren. Umgekehrt ist ihre Reaktion bei geringfügiger Verformung vergleichbar mit Festkörpern⁵. Darüber hinaus gibt es innerhalb dieses kleinen Verformungsbereichs einen Verformungsbereich, in dem Biofilme eine lineare Kraft-Weg-Beziehung aufweisen ^5,6,7. Verformungen innerhalb dieses linearen Bereichs sind optimal für die Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Biofilmen, da diese reproduzierbare Messungen liefern. Mehrere Techniken können die elastische Reaktion innerhalb dieses Bereichs quantifizieren. Die optische Kohärenzelastographie (OCE) ist eine aufstrebende Technik, die für die Analyse von Biofilmen in diesem linearen Bereich (Stämme in der Größenordnung von 10-4-10-5) angepasst ^wird8,9.

Die bisher etablierteste Anwendung von OCE liegt im biomedizinischen Bereich, wo die Technik zur Charakterisierung biologischer Gewebe angewendet wurde, die nur einen oberflächlichen optischen Zugang erfordern. Zum Beispiel verwendeten Li et al. OCE, um die elastischen Eigenschaften von Hautgewebe zu charakterisieren¹⁰. Andere Autoren charakterisierten die anisotropen elastischen Eigenschaften von Schweine- und menschlichem Hornhautgewebe und wie sie durch den Augeninnendruck beeinflusst werden 11,12,13,14,15,16. Einige Vorteile der OCE-Methode zur Untersuchung von Biofilmen sind, dass sie zerstörungsfrei ist und eine mesoskalige räumliche Auflösung bietet, keine Probenvorbereitung erfordert und die Methode selbst schnell ist; Es bietet co-registrierte Messungen der physikalischen Struktur und der elastischen Eigenschaften (z. B. Porosität, Oberflächenrauheit und Morphologie)8,9,17,18.

Die OCE-Methode misst die lokale Verschiebung von sich ausbreitenden elastischen Wellen in einer Probe mittels phasensensitiver optischer Kohärenztomographie (OCT). OCT ist ein optisches Interferometer mit niedriger Kohärenz, das lokale Änderungen der Probenverschiebung in eine Intensitätsänderung umwandelt, die mit einem optischen Spektrometer aufgezeichnet wird. Die OCT-Technik wurde auch in der Biofilmforschung zur Charakterisierung der mesoskaligen Struktur, der Porositätsverteilung in drei Dimensionen und der Biofilmverformung eingesetzt 17,19,20,21. Darüber hinaus schätzten Picioreanu et al. die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen unter Verwendung der inversen Modellierung von OCT-Querschnittsdeformationsbildern²².

Andererseits liefern OCE-Messungen, gekoppelt mit inverser elastodynamischer Wellenmodellierung, die Wellengeschwindigkeit elastischer Wellen in der Probe, was die Charakterisierung der elastischen und viskoelastischen Eigenschaften der Probe ermöglicht. Unsere Gruppe adaptierte die OCE-Technik für die quantitative Messung der elastischen und viskoelastischen Eigenschaften von Biofilmen ^8,9,18 und validierte die Technik gegen Scherrheometriemessungen in Agarose-Gelplattenproben¹⁸. Der OCE-Ansatz liefert präzise und zuverlässige Schätzungen der Biofilmeigenschaften, da die gemessene elastische Wellengeschwindigkeit mit den elastischen Eigenschaften der Probe korreliert. Darüber hinaus kann der räumliche Abfall der elastischen Wellenamplitude aufgrund viskoser Effekte im Material direkt mit den viskoelastischen Eigenschaften korreliert werden. Wir haben OCE-Messungen der viskoelastischen Eigenschaften von bakteriellen Biofilmen aus Mischkulturen, die auf Coupons in einem rotierenden Ringreaktor (RAR) gezüchtet wurden, und granularen Biofilmen mit komplexen Geometrien unter Verwendung elastodynamischer Wellenmodelle¹⁸ berichtet.

Die OCE-Technik ist auch eine leistungsstarke Alternative zur herkömmlichen Rheometrie¹⁸, die zur viskoelastischen Charakterisierung verwendet wird. Rheometriemethoden eignen sich am besten für Proben mit planarer Geometrie. Daher können körnige Biofilme, die beliebige Formen und Oberflächenmorphologien aufweisen, mit einem Rheometer nicht genau charakterisiert werden ^8,23. Darüber hinaus kann es im Gegensatz zu OCE schwierig sein, Rheometriemethoden für Echtzeitmessungen anzupassen, z. B. während des Biofilmwachstums in Flusszellen ^24,25.

In dieser Arbeit zeigen wir, dass OCE-Messungen der frequenzunabhängigen Wellengeschwindigkeit von Oberflächenwellen verwendet werden können, um die elastischen Eigenschaften des Biofilms zu charakterisieren, ohne dass komplizierte Modelle erforderlich sind. Diese Entwicklung wird den OCE-Ansatz für die breitere Biofilm-Community zugänglicher machen, um die mechanischen Eigenschaften von Biofilmen zu untersuchen.

Abbildung 1 zeigt eine schematische Darstellung des in dieser Studie verwendeten OCT-Systems. Das System umfasst mehrere Instrumente, darunter ein kommerzielles phasenempfindliches OCT-System im Spektralbereich, einen Verzögerungsgenerator, einen Funktionsgenerator und einen piezoelektrischen Wandler. Das OCT-System arbeitet nach dem Prinzip der Interferometrie mit einer breitbandigen Lichtquelle mit einer Mittenwellenlänge von 930 nm. Die gesammelte Lichtintensität, die mit komplizierten strukturellen Details in der Probe korreliert, wird in der Nachbearbeitungseinheit analysiert und dann in ein Querschnittsbild der Probe umgewandelt – allgemein als OCT-Bild bezeichnet. Die OCT-Bildgebungstiefe hängt von der Schwere der optischen Streuung in der Probe ab, die auf lokale Variationen des Brechungsindex zurückzuführen ist und in biologischen Geweben und Biofilmen auf 1-3 mm begrenzt ist. Da die optische Phase in der Probe und die Interferenzintensität durch Bewegung moduliert werden, kann das OCT zur Detektion der lokalen Probenverschiebung verwendet werden. Wir nutzen die Verschiebungsempfindlichkeit des OCT in der OCE-Methode, um das stationäre Verschiebungsfeld elastischer Wellen in der Probe zu verfolgen. Konkret gibt der Funktionsgenerator eine sinusförmige Spannung aus, um den piezoelektrischen Wandler anzutreiben. Der Wandler wiederum dehnt und zieht sich mit einem oszillierenden Zeitverlauf zusammen. Die oszillatorische Verschiebung des Wandlers überträgt durch eine 3D-gedruckte Keilspitze an der Spitze des Wandlers eine sinusförmige Kraft auf die Probenoberfläche, die zur Erzeugung harmonischer elastischer Wellen in der Probe führt. Die Keilspitze hat leichten Kontakt mit der Probe, so dass die Probe intakt bleibt, nachdem der Aktuator von der Probenoberfläche zurückgezogen wurde. Um die lokale Verschiebung in der Probe aufzuzeichnen, werden an jedem Pixel in der Probe benachbarte Tiefenscan aufgenommen, die durch eine feste Zeitverzögerung getrennt sind. Die optische Phasendifferenz zwischen aufeinanderfolgenden Scans an jedem Pixelpunkt ist proportional zur lokalen vertikalen Verschiebung am selben Punkt. Die Synchronisation zwischen der Verschiebung des Wandlers und der Abtastoptik im OCT-System wird durch einen Triggerimpuls erreicht, der vom Funktionsgenerator ausgeht und im Verzögerungsgenerator verzögert wird. Dieser Synchronisationsschritt ermöglicht die Aufnahme konsistenter Querschnittsbilder der lokalen optischen Phasenverteilung in der Probe. Diese Bilder sind direkt proportional zur lokalen vertikalen harmonischen Verschiebung in der Probe und werden als OCE-Bild bezeichnet. OCE-Bilder werden bei unterschiedlichen Betätigungsfrequenzen des Wandlers aufgenommen, um die elastische Wellenlänge und Wellengeschwindigkeit als Funktion der Frequenz zu erhalten. Die gemessenen Wellengeschwindigkeiten werden mit einem elastodynamischen Modell analysiert, um die elastischen Eigenschaften der Probe zu bestimmen.

Protocol

1. Systemeinrichtung Sammeln Sie die Systemkomponenten, zu denen das kommerzielle OCT-System (Basiseinheit, Stativ, Bildkopf und Computer), Signalgenerator, Wandler, Verzögerungs-/Impulsgenerator, ein Schalter mit BNC-Anschlüssen, BNC-Kabel und -Adapter, optische Stifte und Klemmen gehören. Schließen Sie das Sync-Signal vom Funktionsgenerator an einen Schalter an. Verbinden Sie den anderen Port des Switches mit dem Verzögerungsgenerator. Verbinden Sie den Ausgang des Fu…

Representative Results

In dieser Studie verwendeten wir körnige Biofilme (auch bekannt als körniger Schlamm), die kommerziell gewonnen wurden. Granulate sind kugelförmige Biofilme, die sich durch Selbstaggregation bilden, was bedeutet, dass sie keinen Träger oder eine Oberfläche benötigen, auf der sie wachsenkönnen 26. Abbildung 3A zeigt ein repräsentatives Querschnittsbild der OCT, das durch die räumliche Variation des lokalen Brechungsindex in einem granulären …

Discussion

Die erreichbare Abbildungstiefe im OCT-System wird durch den Grad der Lichtdurchdringung von der Lichtquelle bestimmt, der von der Wellenlänge der Quelle abhängt. Darüber hinaus bestimmt die Wellenlänge die axiale Auflösung. Längere Wellenlängen können tiefer in die Probe eindringen, jedoch auf Kosten einer geringeren axialen Auflösung im Vergleich zu kürzeren Wellenlängen. Die transversale Auflösung hingegen hängt sowohl von der numerischen Apertur des Systems als auch von der Wellenlänge ab, wobei kürzer…

Materials

3D printed sample holder
3D printed wedge tip			3 mm width
BNC cables	Any brand
Delay generator	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Digital delay/ Pulse Generator
Function generator	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Function / Arbitrary Waveform Generator
Granular biofilm	Aqua-Aerobic Systems		Obtained from an Aerobic Granular Sludge reactor (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Piezoelectric transducer	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 µm Displacement
SD-OCT System	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 scan lens
ThorImageOCT	Thorlabs		Version: 5.5.5