Un ensayo para detectar la protección de la vasculatura de la retina frente a la muerte relacionada con la diabetes en ratones

Summary

Se desarrolló un ensayo de protección para monitorizar la resistencia de la vasculatura de la retina a la muerte por lesiones relacionadas con la diabetes/retinopatía diabética, como el estrés oxidativo y las citocinas.

Abstract

La retinopatía diabética (RD) es una enfermedad ocular compleja y progresiva caracterizada por dos fases diferenciadas en su patogenia. La primera fase implica la pérdida de protección contra el daño a la retina inducido por la diabetes, mientras que la segunda fase se centra en la acumulación de este daño. Los ensayos tradicionales se centran principalmente en la evaluación de la degeneración capilar, que es indicativa de la gravedad del daño, abordando esencialmente la segunda fase de la RD. Sin embargo, solo proporcionan información indirectamente sobre si los mecanismos protectores de la vasculatura de la retina se han visto comprometidos. Para abordar esta limitación, se desarrolló un enfoque novedoso para evaluar directamente los mecanismos protectores de la retina, específicamente, su resistencia contra las agresiones inducidas por la diabetes, como el estrés oxidativo y las citoquinas. Este ensayo de protección, aunque inicialmente se diseñó para la retinopatía diabética, tiene el potencial de aplicaciones más amplias tanto en contextos fisiológicos como patológicos. En resumen, comprender la patogénesis de la retinopatía diabética implica reconocer las fases duales de la pérdida de protección y la acumulación de daños, y este innovador ensayo de protección ofrece una herramienta valiosa para la investigación y puede extenderse a otras afecciones médicas.

Introduction

La retinopatía diabética (RD) es una de las complicaciones microvasculares de la diabetes mellitus (DM) y la primera causa de ceguera en personas en edad laboral en los países desarrollados¹. Los principales factores de riesgo para la retinopatía diabética son la duración y el grado de hiperglucemia ^2,3,4. Mientras que la DM causa disfunción de los componentes vasculares y neurales de la retina⁵, el diagnóstico de RD se basa en las características morfológicas de la vasculatura retiniana⁶.

El estrés oxidativo inducido por la hiperglucemia es uno de los impulsores de la patogénesis de la RD⁷. El aumento del estrés oxidativo causa daños generalizados, lo que compromete la funcionalidad de las mitocondrias y, por lo tanto, aumenta aún más el nivel de especies reactivas de oxígeno. Estos eventos se acompañan de fugas de vasos retinianos, un aumento en el nivel de citoquinas inflamatorias y la muerte de los tipos de células neurales y vasculares dentro de la retina. La pérdida de células vasculares y, por lo tanto, la funcionalidad de la extensa red capilar de la retina, da lugar a la hipoxia, un potente estímulo para una variedad de respuestas⁵. Tales respuestas incluyen el aumento de la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) que impulsa tanto la permeabilidad como la angiogénesis, características cardinales de las etapas avanzadas y amenazantes para la vista de la RD – edema macular diabético y retinopatía diabética proliferativa⁶.

Ciertas características de la RD sugieren que un organismo (tanto pacientes como animales de experimentación) tiene una capacidad intrínseca para resistir esta indicación. Los pacientes experimentan varias décadas de DM antes de desarrollar RD que amenaza la vista 8,9,10,11,12,13. Mientras que los modelos de DM en roedores no desarrollan las etapas avanzadas y amenazantes para la vista de la RD¹⁴, la forma inicial/leve de la RD que se manifiesta lo hace solo después de un período de semanas o meses de DM^15,16. Además, tanto en pacientes como en animales de experimentación, la RD es progresiva y la disfunción/daño de la retina aumenta a medida que se prolonga la duración de la DM. Por último, algunos pacientes con DM nunca desarrollan RD. En ciertos casos, esto se debe a que estas personas no experimentan diabetes el tiempo suficiente para que se desarrolle la RD. En otros casos, se debe a que muestran una resistencia extraordinaria a la RD; como es el caso de los participantes del estudio Medalist, que no desarrollan RD después de 50 o más años de DM¹⁷. A pesar de este apoyo convincente a la existencia de la protección contra la RD y su enorme relevancia traslacional, el mecanismo subyacente a la protección no se ha investigado de manera agresiva.

El ensayo de protección descrito en este documento se desarrolló para facilitar la investigación de por qué la RD se retrasa desde el inicio de la DM en ratones diabéticos. Los pasos clave de este ensayo, aplicado a ratones con DM y sin DM, incluyen (1) administrar una lesión ocular inductora de muerte submáxima (ex vivo o in vivo), (2) aislar la vasculatura de la retina, (3) teñir la vasculatura con TUNEL y DAPI, (4) fotografiar las imágenes resultantes y cuantificar el porcentaje de especies doble positivas de TUNEL/DAPI.

Protocol

Todos los estudios en animales fueron aprobados por la Oficina de Cuidado Animal y Bioseguridad Institucional de la Universidad de Illinois en Chicago. Los ratones machos C57/BL6/J de siete semanas de edad se alojaron en jaulas grupales en un entorno libre de patógenos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se les proporcionó acceso gratuito a alimentos y agua. Los ratones fueron sacrificados por asfixia con CO2 , y los ojos fueron enucleados y procesados inmediatamente18. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las herramientas esenciales necesarias para el estudio se muestran en la Figura 1. 1. Pronunciación del insulto que induce a la muerte Realizar estrés oxidativo con TBH (ex vivo).Sacrificar a los ratones siguiendo protocolos aprobados institucionalmente y enuclear sus ojos18 (Figura 2A). Coloque los globos oculares directamente en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos que contenga DMEM + 1% de BSA, con o sin 5 mM de hidroperóxido de terc-butilo (TBH) (consulte la Tabla de materiales); incubar durante 1 h a 37 °C. Una muestra de control positivo se trata con DNasa (50 U/100 μL) durante 10 min para fragmentar el ADN.NOTA: La dosis de TBH (el agente que induce el estrés oxidativo) fue elegida para inducir un nivel fácilmente detectable y sub-máximo de muerte celular dentro de los vasos retinianos aislados18. Fijar los ojos en formol tamponado al 10% durante la noche (mínimo 16 h). Use un cóctel de citoquinas para inducir la inflamación (in vivo).Anestesiar a los ratones con una inyección intraperitoneal de 100 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina. Utilice una aguja personalizada de 33 G (consulte la tabla de materiales) para inyectar 1 μL/ojo del cóctel de citocinas en el vítreo; el lugar de la inyección está a 2-3 mm del limbo (Figura 2B).NOTA: El cóctel de citocinas contiene una proporción de 1:1:1 de 1 μg/ml de TNF-α, 1 μg/ml de IL-1β y 1500 U/μl deIFN-γ 18 (véase la tabla de materiales). 24 h después de la inyección, eutanasiar a los ratones (siguiendo los protocolos aprobados institucionalmente), enuclearles los ojos y fijarlos con formol tamponado al 10% durante la noche.NOTA: El experimento se puede pausar después de la fijación durante un máximo de 1 semana y luego reiniciarse más tarde. 2. Aislamiento de la retina Corta el globo ocular.Use fórceps rectos para agarrar el nervio óptico suavemente (Figura 2C). Sostenga un microcuchillo con la otra mano para hacer una incisión de 2-3 mm posterior al limbo. Cambie del microcuchillo a las microtijeras para cortar paralelo al limbo mientras gira el globo ocular junto con el nervio óptico hasta que el globo ocular se haya cortado en dos mitades. Deseche la mitad anterior del ojo, incluido el cristalino (Figura 2C). Retira la esclerótica.Use pinzas rectas para levantar suavemente la esclerótica de 1 a 3 mm de la retina. Use microtijeras para hacer dos cortes radiales en la parte de la esclerótica que conduce al nervio óptico. Evite cortar la retina subyacente. Use un par de pinzas curvas para agarrar el colgajo escleral y arrancarlo de la retina. La capa RPE se desprenderá con la esclerótica. Lavar la retina.Use una microespátula para transferir la retina aislada a un pocillo dentro de un plato de 24 pocillos que se haya llenado con agua destilada doble. Agite suavemente el plato a velocidad media-moderada a temperatura ambiente. Cambie el agua cada 30 minutos a 1 hora, al menos 4-5 veces, luego déjela toda la noche. 3. Aislamiento de la vasculatura retiniana Digestión: Sustituir el agua bidestilada por 800 μL de solución de tripsina YL (tripsina al 3% en tampón Tris 0,1 M (pH 7,8)). Incubar a 37 °C con agitación suave o nula durante 4 h 15 min19 (Figura 2D).NOTA: Evite las sacudidas rápidas, ya que esto puede dañar la vasculatura. Transferencia: Sumerja el extremo ancho de una pipeta de transferencia de vidrio con una solución de tripsina YL para transferir la retina a una placa de Petri de 35 mm que contenga agua de doble destilación sin pelusa. Retire la capa nuclear externa (fotorreceptores) (Figura 2E).Dale la vuelta a la semiesfera de la retina mirando hacia abajo. Usa el cepillo recto de un solo pelo para presionar suavemente la retina contra el fondo del plato. Use el cepillo de bucle para cepillar suavemente los fotorreceptores de la retina. Las pinceladas se aplican en una dirección desde el nervio óptico hacia la periferia de la retina. Los fotorreceptores pueden desprenderse en láminas grandes porque no están anclados al resto de la retina por vasos sanguíneos. Uso de una pipeta de 200 μL para recoger y desechar las láminas de tejido neural. Retira el vítreo.Dale la vuelta a la semiesfera de la retina para que mire hacia arriba. Use un par de pinzas curvas (A) para agarrar el vítreo tanto como sea posible bajo un microscopio de disección.NOTA: El vítreo se ve como una lámina de tejido transparente adherida al nervio óptico o a la retina. Use otra pinza curva (B) para agarrar el extremo del vítreo donde conecta el nervio óptico. Retire el vítreo tirando de las pinzas A para separarlas de las pinzas B. Deseche el vítreo. Examine el remanente del vítreo y repita este paso para eliminar todo el vítreo, ya que el residuo impedirá los siguientes pasos. Retire el tejido neural y glial restante (Figura 2F).Dale la vuelta a la semiesfera de la retina para que vuelva a estar mirando hacia abajo. Una vez más, use el cepillo recto para presionar suavemente la retina contra el fondo del plato (no use la punta del cabello). Utilice el cepillo de bucle para cepillar suavemente la vasculatura desde la cabeza del nervio óptico hacia la periferia para eliminar el tejido neural restante20. Gire la retina lentamente con el cepillo recto y use el cepillo de bucle para eliminar todos los pequeños trozos de tejido neural en la vasculatura de la retina, hasta que la red vascular esté bien limpia (Figura 2G, H). 4. Montaje de la vasculatura retiniana aislada en un portaobjetos de microscopio Coloque un portaobjetos de microscopio.Coloque un casete de montaje limpio (consulte la Tabla de materiales) bajo un microscopio de disección. Llene el casete con agua bidestilada. Use un fondo negro debajo del microscopio de disección para ayudar a generar contraste para ver la vasculatura transparente iluminada. Use pinzas para colocar un portaobjetos de microscopio limpio y etiquetado en la parte inferior del casete de montaje. Transferir la vasculatura retiniana.Sumerja el extremo ancho de una pipeta de transferencia de vidrio con una solución de tripsina YL. Transfiera la vasculatura de la retina limpia y desaloje suavemente la vasculatura en el agua de doble destilación dentro del casete de montaje y sobre el portaobjetos del microscopio. Montar la vasculatura retiniana.NOTA: Mientras la vasculatura está flotando sobre el portaobjetos del microscopio, la vasculatura aislada adquirirá su forma normal de cuenco.Use el cepillo de bucle para voltear la semiesfera de la retina hacia arriba y empuje suavemente la vasculatura hacia abajo sobre el portaobjetos de vidrio, y luego use el cabello para clavar la vasculatura abierta en el centro del portaobjetos. La vasculatura debe adherirse al portaobjetos a medida que se toca. Montar la vasculatura plana cepillando el vaso retiniano en forma de cuenco desde el nervio óptico hasta la periferia. Repita el cepillado en todas las direcciones hasta que la vasculatura se adhiera completamente al portaobjetos. Secar al aire la vasculatura de la retina.Una vez que toda la vasculatura de la retina se adhiera al portaobjetos, sáquelo del agua, ya sea levantando suavemente un borde o drenando lentamente el agua en la esquina del casete para minimizar las corrientes, y luego tirando de él hacia afuera (Figura 2I).NOTA: La vasculatura se hará fácilmente visible una vez que se haya secado al aire (Figura 2J). Marque la circunferencia de la vasculatura de la retina en la parte posterior del portaobjetos con un rotulador. Proceda a teñir la muestra sin pausa. 5. Detección de muertes con tinción TUNEL NOTA: Para obtener más información sobre este procedimiento, consulte Zheng et al.21. En la Figura 3 se muestran imágenes representativas de cuerpos apoptóticos inducidos por estrés de isquemia +/- buey en vasos retinianos aislados. Rehidratar la vasculatura aislada con PBS. Enjuagar 3 veces en PBS y luego incubar con Triton X-100 al 1% en PBS durante 2 min en hielo para permeabilizar la vasculatura aislada. Enjuague los portaobjetos dos veces con PBS para eliminar los residuos de Triton X-100. Seque el área alrededor de la muestra. Añadir 50 μL de mezcla de reacción TUNEL (ver Tabla de Materiales) a la muestra. Incubar el portaobjetos en una atmósfera humidificada durante 60 minutos a 37 °C en la oscuridad. Enjuague el portaobjetos 3 veces con PBS para eliminar la mezcla de reacción TUNEL. Seque el área alrededor de la muestra. Agregue una gota de medio de montaje DAPI para teñir los núcleos con DAPI y monte la muestra con un cubreobjetos. Conservar a 4 °C en la oscuridad.NOTA: El protocolo puede pausarse hasta 1 semana antes de capturar imágenes. Fotografíe la vasculatura resultante con un microscopio de fluorescencia confocal (ver Tabla de Materiales). Capture de seis a ocho campos seleccionados al azar en la periferia lejana que rodea el nervio óptico (Figura 4).NOTA: En la Figura 5 se ilustran imágenes representativas de cuerpos apoptóticos inducidos por citocinas en vasos retinianos aislados. Analiza los resultados.En el caso de muestras ex vivo tratadas con TBH, realice los siguientes pasos.Cuente el número de cuerpos apoptóticos (especies doblemente positivas de TUNEL/DAPI) en cada campo utilizando la Imagen J (ver Tabla de Materiales). Contar la media de los cuerpos apoptóticos en todos los campos de una sola muestra. Calcule el cambio de pliegue en el número de cuerpos apoptóticos entre un par seleccionado al azar de muestras sin DM y con MS. Determine si existe una diferencia estadísticamente significativa utilizando la prueba t de Student de dos colas18.NOTA: Tiñir las muestras de control y experimentales (no DM y MS) en la misma ocasión porque el alcance de la tinción TUNEL puede variar, incluso cuando se realiza de la misma manera. Dado que un usuario experimentado puede limpiar y montar hasta 10 retinas por día, planee procesar un número igual de retinas de control y experimentales antes de comenzar este protocolo. Para muestras in vivo, citoquinas tratadas con cóctel, realice los siguientes pasos.Contar manualmente el número de cuerpos apoptóticos (especies doblemente positivas TUNEL/DAPI) en toda la vasculatura retiniana. Calcule el cambio de pliegue en el número de cuerpos apoptóticos entre un par seleccionado al azar de muestras sin DM y con MS. Determine si hay una diferencia estadísticamente significativa utilizando la prueba t de Student de dos colas.

Representative Results

El aislamiento exitoso de la vasculatura retiniana da como resultado un montaje plano de toda la red de la vasculatura retiniana del ratón, con la integridad arquitectónica intacta (Figura 2J). Al tingarse con hematoxilina de Schiff de ácido peryódico (PASH), es posible distinguir los dos tipos de células vasculares: células endoteliales (CE) y pericitos (PC) (Figura 6). Los núcleos de las células endoteliales son alargados, ligeramente teñidos y residen completamente dentro de las paredes de los vasos. Los núcleos de los pericitos son circulares, densamente teñidos y sobresalen de las paredes capilares. Las muestras teñidas con PASH también revelan capilares acelulares, que carecen de núcleo. El enfoque para inducir la muerte se guió por el siguiente razonamiento. Se especuló que la protección era limitada, es decir, que podía verse abrumada por un insulto muy fuerte que inducía a la muerte. En consecuencia, las agresiones (tanto de isquemia/estrés oxidativo como de citocinas18) se optimizaron para que indujeran un aumento fácilmente detectable, pero aún por debajo de la extensión máxima de la muerte (Figura 3 y Figura 5). Es importante destacar que la presencia de núcleos TUNEL-positivos estuvo supeditada al tipo específico de agresión empleada para desencadenar la muerte celular. La lesión por isquemia/estrés oxidativo condujo a un patrón de apoptosis celular, como se ilustra en la Figura 3, mientras que la lesión por citocinas dio lugar a un patrón distinto y bien definido, como se muestra en la Figura 5. Ambos patrones pueden observarse en vasos retinianos de pacientes con RD22, lo que sugiere que ambos tipos de agentes inducen la muerte celular en humanos. Además, las distinciones morfológicas observadas ofrecen un medio para evaluar si la patología fue impulsada por el estrés oxidativo o por citoquinas. Figura 1: Herramientas para aislar la vasculatura retiniana del ratón. De izquierda a derecha: el casete de montaje, dos cepillos de un solo pelo, una pipeta de transferencia invertida, una microespátula, dos pinzas curvas, tijeras de resorte, microcuchillo y pinzas con puntas rectas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Esquema que muestra los pasos clave para infligir un insulto que induce a la muerte y luego aislar la vasculatura de la retina del ojo de un ratón. (A) Inducción de isquemia/lesión oxidativa, ex vivo. Después de la enucleación, el globo ocular se somete a isquemia en presencia de TBH. (B) Administración in vivo (inyección intravítrea) de citoquinas. (C) Cortar el globo ocular en dos mitades. (D) Digestión enzimática retiniana: extirpación de la esclerótica y lavado de la retina en agua bidestilada durante la noche. Incubación en solución de tripsina YL a 37 °C durante 4 h 15 min en un pocillo de una placa de 24 pocillos. (E) Extracción de los fotorreceptores. (F) Extirpación del tejido neural y glial restante. (G) Red vascular limpia en forma de cuenco mirando hacia arriba. (H) Red vascular aislada en una placa de 35 mm con fondo negro en la platina de un microscopio de disección. (I) Vasculatura retiniana de montaje plano en un portaobjetos. (J) Vasculatura retiniana secada al aire en un portaobjetos. Esta figura ha sido modificada a partir de Li et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Detección de cuerpos apoptóticos dentro de vasos retinianos de ratón tratados ex vivo con isquemia +/- TBH. Imágenes representativas de cuerpos apoptóticos inducidos por estrés de ox +/- de isquemia en vasos retinianos aislados. El encabezado de cada columna indica la tinción. (A-C) Vasos retinianos aislados de globos oculares que sufrieron 1 h de isquemia sola. (D-F) Igual que (A-C), excepto que el insulto de 1 h fue una combinación de isquemia y estrés oxidativo (5 mM TBH). Las flechas rojas apuntan a especies representativas de doble positividad de TUNEL/DAPI. (G-I) Control positivo tratado con DNasa. Barra de escala = 50 μm. Esta figura ha sido modificada a partir de Li et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Ilustración de la selección de campos para la cuantificación de los resultados. Un escaneo en mosaico de 5 x 5 de la vasculatura de la retina con la fusión de la señal TUNEL y DAPI. La selección de seis a ocho campos en la periferia lejana que rodea el nervio óptico se muestra con cuadrados rojos. Aumento, 200x. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5: Detección de los cuerpos apoptóticos dentro de los vasos retinianos de ratón en respuesta a la inyección intravítrea de citoquinas (administración in vivo). Imágenes representativas de cuerpos apoptóticos inducidos por citocinas en vasos retinianos aislados. El encabezado de cada columna indica la tinción. (A-C) Imágenes de los vasos retinianos aislados de ratones inyectados intravítreamente con PBS. (D-F) Igual que (A-C), excepto que se inyectó un cóctel de citoquinas junto con PBS. Las flechas rojas apuntan a especies representativas positivas para TUNEL. Barras de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada a partir de Li et al.18. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 6: Imagen representativa de los vasos retinianos teñidos con PASH. Los vasos retinianos de un ratón que experimentó 20 semanas de DM inducida por STZ se aislaron como se describe en la Figura 2, se tiñeron con PASTA y se obtuvieron imágenes mientras estaban iluminados con luz visible. Los núcleos de pericitos en los capilares tienden a ser más circulares y densamente teñidos (flechas azules), mientras que los núcleos alargados y menos densamente teñidos son diagnósticos de células endoteliales (flechas rojas). La flecha amarilla apunta a un capilar acelular. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

En este estudio, se estableció un ensayo para detectar resistencia/vulnerabilidad de la vasculatura retiniana a la muerte inducida por lesiones relacionadas con DM/RD como isquemia/estrés oxidativo y citoquinas. Este manuscrito proporciona una descripción detallada de este ensayo, que es una modificación de varios protocolos publicados 19,20,21.

El protocolo abarca varias etapas cruciales. En primer lugar, es imperativo diseccionar meticulosamente la retina, asegurando la preservación de la red vascular y evitando desgarros sustanciales. Esto se puede lograr haciendo una incisión de 2-3 mm posterior al limbo, ya que la retina se adhiere firmemente a la ora serrata, y separarla es un desafío. En segundo lugar, cubra todos los instrumentos que entren en contacto con los vasos (p. ej., cepillos de un solo pelo, pipeta de transferencia y fórceps) con tripsina sumergiendo estas herramientas en la solución de tripsina YL durante todo el procedimiento. Esto evita que la vasculatura se adhiera a los instrumentos que se utilizan en este protocolo. En tercer lugar, debido a que la microvasculatura es casi invisible bajo la luz normal, se requiere una mayor vigilancia durante la aspiración de desechos y la transferencia al portaobjetos del microscopio para evitar pérdidas accidentales.

Un grado adecuado de digestión enzimática de las distintas capas de la retina es crucial; La digestión insuficiente impide la separación del tejido neuronal de la red vascular, mientras que la digestión excesiva disuelve el plexo vascular. Se han reportado varios tiempos de digestión que van desde 1 h¹⁹ hasta ²³ durante la noche. Según las observaciones, un tiempo de digestión de 4 h y 15 min produce los resultados más favorables en comparación con las duraciones de 2 h, 3 h y 4 h. Es poco probable que prolongar la digestión más allá de este punto mejore el proceso y, en cambio, podría comprometer la integridad de la vasculatura.

En los casos en que la retina digerida se adhiera al cepillo de un solo cabello, sumerja el cabello en la solución de tripsina YL varias veces. Esto reduce las áreas pegajosas del cepillo. Si el cepillo para el cabello aún se adhiere al tejido vascular, inspecciónelo en busca de fragmentos residuales de vítreo y retírelos con fórceps.

El momento óptimo para la eliminación completa del vítreo es después de la eliminación de los fotorreceptores, pero antes de la eliminación del tejido neural y glial restante. La retina mantiene la rigidez hasta que se eliminan los fotorreceptores. La extracción del vítreo en esta etapa podría desgarrar la retina/vasculatura. Las delicadas capas de tejido neural y glial residual desempeñan un papel fundamental en la preservación de la forma curva de la estructura vascular. Evitan que la retina se desgarre en su centro cuando el vítreo se separa del nervio óptico.

Si la vasculatura aislada no se adhiere en absoluto al portaobjetos del microscopio, indica que la sección del portaobjetos donde se espera que se produzca la adhesión está sucia. Intente mover los recipientes a través de la superficie del portaobjetos para localizar un punto pegajoso, cambie a un portaobjetos diferente o limpie meticulosamente el portaobjetos y vuelva a intentarlo. Si los vasos se adhieren al portaobjetos antes de que se desplieguen en su forma de cuenco, levante la vasculatura del portaobjetos para permitir que flote libremente en el agua una vez más. Realice este paso con pinzas que se hayan sumergido repetidamente en la solución de tripsina YL.

Se han descrito varias técnicas alternativas para aislar la vasculatura, que no serían adecuadas para el ensayo de protección descrito en este documento. Por ejemplo, la lisis osmótica se ha empleado para aislar la vasculatura de muestras de retina no fijadas, facilitando las investigaciones bioquímicas del tejido^24,25. Sin embargo, es posible que este procedimiento no preserve la anatomía de la vasculatura tan bien como el enfoque empleado en este artículo. Del mismo modo, mientras que el método de impresión de tejidos para aislar grandes segmentos de microvasculatura permite analizar la arquitectura electrotónica de la vasculatura²⁶, normalmente no se recupera todo el lecho vascular.

Este ensayo se desarrolló porque los enfoques existentes para controlar la degeneración capilar no abordan el problema de la protección. La degeneración capilar, que se produce después de una DM prolongada, indica si se ha desarrollado RD. Además de diagnosticar la RD, este resultado es útil para evaluar si un agente o terapia previene la RD. Sin embargo, los ensayos de degeneración capilar existentes no hablan del mecanismo de acción subyacente del agente. Un agente de este tipo puede prevenir los eventos patológicos que impulsan la RD, como el aumento del estrés oxidativo o las citoquinas. Alternativamente, el agente puede reforzar la protección al mejorar la resistencia al estrés oxidativo y las citocinas y/o promover la reparación del daño. Este nuevo ensayo de protección se puede utilizar para determinar si el efecto beneficioso de una terapia determinada implica reforzar el sistema endógeno que protege de la muerte relacionada con la DM.

Un inconveniente de este ensayo de protección es que no distingue los dos tipos de células dentro de los vasos retinianos: células endoteliales (CE) y pericitos (PC). Si bien la apariencia de sus núcleos en secciones teñidas con ASH es específica del tipo de célula (Figura 6), no todos los núcleos muestran características diagnósticas. Aproximadamente el 30% de los núcleos no pueden definirse inequívocamente como CE o CP, al menos en parte, porque las imágenes bidimensionales obtenidas de muestras teñidas con ASH resuelven de forma incompleta la estructura tridimensional del plexo vascular. Este obstáculo podría superarse mediante análisis adicionales, como la tinción inmunofluorescente con marcadores específicos del tipo celular. Dichas imágenes, que distinguen los dos tipos celulares, podrían ser co-teñidas con TUNEL para determinar la resistencia/vulnerabilidad de cada uno de los tipos de células vasculares.

Este ensayo centrado en los vasos sanguíneos no proporciona ninguna información sobre la retina neural. Podrían elaborarse ensayos adicionales para proporcionar dicha información. Por ejemplo, en lugar de aislar la vasculatura de la retina, se podría generar una suspensión de una sola célula de toda la retina y luego analizarla (mediante clasificación de células activadas fluorescentes) en busca de resistencia/vulnerabilidad. La inclusión de marcadores específicos del tipo celular (tanto neurales como vasculares) junto con indicadores de muerte celular proporcionaría una imagen más completa de los tipos de células de la retina que tienen la capacidad de protección contra la muerte mediada por DM/DR.

En conclusión, el ensayo de protección descrito en este documento proporciona un enfoque poderoso para investigar el mecanismo responsable del retraso entre el inicio de la DM y la manifestación de la RD en ratones.

Materials

10% neutral buffered formalin	Fischer Scientific	SF100-4	Fixation
24-well plates	Falcon	353047
33 G needle	Hamilton	customized
Ammonium hydroxide	Sigma	221228-1L-PCA
C57/BL6/J mice	The Jackson Laboratory	Jax #000664
Cytokine cocktail			consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ
Dissecting microscope			Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate.
Dumont #3 forceps	Fine Science Tools (FST)	11231-30	Straight tips
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools (FST)	11253-25	Micro-blunted tips
Easy-Grip Tissue Culture Dishes	Falcon	353001	35 x 10 mm
Glass transfer pipet	Fischer Scientific	1367820A	snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb.
Harris modified hematoxylin	Sigma	HHS32
Image J	NIH, Bethesda		https://imagej.nih.gov/ij/
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein	Milipore	11684795910	TUNEL reaction mixture
Micro cover glasses	VWR	48366-227	22 mm x 22 mm
Microknife	Sharpoint	72-1551
Micro-spatula	Fine Science Tools	10091-12
Mounting cassette			Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide
Periodic acid	Sigma	3951
Periodic acid solution			35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate  in H2O
Permount mounting medium	Fischer Scientific	SP15- 100
Prism 9	GraphPad
Prolog Gold antifade reagent with DAPI	Invitrogen	P36935
Recombinant human IFN- γ	Peprotec	300-02
Recombinant human IL-1 β	Peprotec	200-01B
Recombinant human TNF-α	Peprotec	300-01A
Schiff reagent base	Sigma	3952016
Shaker Incubator (belly button shaker)	IBI Scientific	BBUAAUV1S
Sodium acetate	Sigma	71196
Steritop sterile vacuum bottle	Millipore	SCGPS05RE	Create filtered water
Superfrost Plus treated microscope slides	Fischer Scientific	12-550-15	use slides from unopened box
Tert-butyl hydroperoxide (TBH)	Sigma	75-91-2
TRIZMA base	Fischer Scientific	11-101-5522	make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl)
Trypsin 1:250	Amresco	0458-50G
Two “brushes”			made from single black hair  taped to the end of plastic transfer pipet.  One brush with a free end. The other brush with a loop
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools (FST)	15000-00
Xylene	Sigma	65351-M
YL trypsin solution			3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8)
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope	Zeiss Microscopy