For at imødekomme presserende denguefeberdiagnostiske behov introducerer vi her en smartphone-app-integreret Dengue NS1 papirbaseret analytisk enhed (DEN-NS1-PAD) til kvantificering af Dengue NS1-antigenkoncentration i klinisk serum / blodprøver. Denne innovation forbedrer denguefeberstyring ved at hjælpe klinisk beslutningstagning i forskellige sundhedsindstillinger, selv ressourcebegrænsede.
Dengue-virus (DENV) infektion, som overføres af Aedes myg, er et stort folkesundhedsproblem i tropiske og subtropiske lande. Med en årlig forekomst på ca. 10 millioner tilfælde og 20.000-25.000 dødsfald, især blandt børn, er der et presserende behov for praktiske diagnostiske værktøjer. Tilstedeværelsen af dengue non-strukturelle protein 1 (NS1) under tidlig infektion har været forbundet med cytokinfrigivelse, vaskulær lækage og endoteldysfunktion, hvilket gør det til en potentiel markør for svær denguefeber.
Papirbaserede immunoassays såsom laterale flowassays (LFA’er) og mikrofluidiske papirbaserede analytiske enheder (PAD’er) har vundet popularitet som diagnostiske tests på grund af deres enkelhed, hurtighed, billighed, specificitet og lette fortolkning. Imidlertid er konventionelle papirbaserede immunoassays til dengue NS1-detektion typisk afhængige af visuel inspektion, hvilket kun giver kvalitative resultater. For at imødegå denne begrænsning og øge følsomheden foreslog vi et meget bærbart NS1 dengue-detektionsassay på en papirbaseret analytisk enhed (PAD), nemlig DEN-NS1-PAD, der integrerer en smartphone-applikation som en kolorimetrisk og kvantitativ læser. Udviklingssystemet muliggør direkte kvantificering af NS1-koncentrationer i kliniske prøver.
Serum- og blodprøver opnået fra patienter blev brugt til at demonstrere systemets prototype ydeevne. Resultaterne blev opnået med det samme og kan anvendes til klinisk vurdering, både i veludstyrede sundhedsfaciliteter og ressourcebegrænsede omgivelser. Denne innovative kombination af et papirbaseret immunassay med en smartphone-applikation tilbyder en lovende tilgang til forbedret detektion og kvantificering af dengue NS1-antigen. Ved at øge følsomheden ud over det blotte øjes muligheder har dette system et stort potentiale for at forbedre klinisk beslutningstagning i denguefeberhåndtering, især i fjerntliggende eller underbetjente områder.
Dengue-virus (DENV) infektion er den hurtigst spredende myggebårne sygdom1, og mere end 390 millioner mennesker er inficeret med 96 millioner symptomatiske infektioner, 2 millioner tilfælde af alvorlig sygdom og mere end 25.000 dødsfald om året forekommer i verden 1,2. Ifølge Verdenssundhedsorganisationen (WHO) er anslået 3,9 milliarder mennesker i fare for denguefeber; ~ 70% bor i Asien og Stillehavsområdet og hovedsageligt i Sydøstasien3. I 2019 var antallet af dengue-tilfælde rapporteret til WHO 4,2 millioner, og Thailand bidrog med mindst 136,000 dengue-tilfælde og 144 dødsfald fra dengue-infektion4. Dengue-udbruddet i Thailand forekommer i regntiden, fra april til december, i både byområder og landdistrikter, især i det nordøstlige område.
DENV-infektioner har forskellige kliniske manifestationer lige fra subkliniske symptomer, mild denguefeber (DF) til svær dengue hæmoragisk feber (DHF). Hovedkarakteristikken ved svær DHF-tilstand er øget vaskulær permeabilitet efterfulgt af chok og organdysfunktion1. Forståelse af den molekylære vej, der kan forårsage vaskulær lækage, er meget vigtig for at udvikle effektive dengue-behandlinger. Dengue non-structural protein 1 (NS1) er et udskilt glycoprotein under tidlig virusinfektion 5,6, og det fungerer som en cofaktor for viral RNA-replikation7. NS1 kan udløse cytokinfrigivelse og bidrage til vaskulær lækage ved binding til toll-lignende receptor 4 (TLR4) og endotelglycocalyx 8,9. In vitro forskning har vist, at NS1 interagerer med endotelceller og inducerer apoptose. Denne tilstand kan bidrage til endoteldysfunktion og vaskulær lækage10. NS1 antigen niveauer, korreleret med serum Interleukin (IL)-10 niveauer, blev øget signifikant hos patienter med svær klinisk sygdom11. Dengue NS1 bidrager også til sygdomspatogenese ved at inducere IL-10 og undertrykke DENV-specifikke T-celleresponser12,13. Derudover var dengue NS1-protein relateret til alvorlig klinisk sygdom, og koncentrationen af NS1 > 600 ng ml-1 i de første 3 dage af sygdommen var forbundet med udviklingen af DHF14.
Persistensen af dengue NS1-antigenet hos patienter med DHF kan anvendes som markør for svær dengue6. Der findes flere metoder til påvisning af NS1 i kliniske prøver, såsom enzymbundet immunosorbentassay (ELISA) og hurtigtesten15. Guldstandarden til måling af koncentrationen af NS1-proteiner i kliniske omgivelser er ELISA-metoden. ELISA-metoden er imidlertid dyr og kræver kvalificeret personale og laboratoriefaciliteter16. Derfor er udviklingen af teknologi til påvisning og kvantificering af NS1-proteiner i point-of-care testen (POCT) stadig i gang. I det sidste årti er papirbaserede immunoassays såsom laterale flowassays (LFA’er) og mikrofluidiske papirbaserede analytiske enheder (μPAD’er) blevet populære som diagnostiske tests på grund af deres enkelhed, hurtighed, billighed og specificitet 17,18,19. I et papirbaseret immunassay er flere etiketter blevet brugt til at generere signaler, såsom guldnanopartikler (AuNP’er)20, magnetiske nanopartikler21,22, kvantepunkter23 og fluorescensmaterialer24,25. AuNP’er er de mest almindelige etiketter, der anvendes i papirbaserede immunoassays på grund af deres billige produktionsomkostninger, brugervenlighed, stabilitet og enkel udlæsning. I øjeblikket anvendes laterale flowassays (LFA’er) til dengue NS1 berømt i den kliniske indstilling26,27. Imidlertid bruger konventionel LFA-etiketdetektion almindeligvis det blotte øje og giver kun kvalitative resultater.
I det sidste årti er mere end 5 milliarder smartphones blevet brugt i vid udstrækning globalt, og der er potentiale for at udvikle bærbar detektion28,29. Smartphones har multifunktionelle kapaciteter såsom indbyggede fysiske sensorer, multi-core processorer, digitale kameraer, USB-porte, lydporte, trådløs og applikationssoftware, hvilket gør dem velegnede til brug i forskellige biosensorplatforme30. Desuden gør trådløse teknologier det muligt at sende data hurtigt og kan anvendes til overvågning i realtid og på stedet31. Mudanyali et al. kombinerede det papirbaserede immunassay og smartphones for at udvikle en bærbar, udstyrsfri, hurtig, billig og brugervenlig POCT-platform til malaria, tuberkulose og HIV32. Ling et al. rapporterede et lateralt flowassay kombineret med et smartphone-kamera til kvantitativ påvisning af alkalisk fosfataseaktivitet i mælk33. Hou et al. udviklede også et smartphone-baseret, dual-modality billeddannelsessystem til kvantitative signaler fra farve eller fluorescens i lateral flow assay34. Derudover kan brug af smartphone som kolorimetrisk og kvantitativ læser forbedre følsomheden, mens det blotte øje ikke med sikkerhed kan rapportere tilstedeværelsen af målet35.
DEN-NS1-PAD 36,37,38 (herefter kaldet enheden) præsenterer et gennembrud inden for dengue-diagnostik og tilbyder en bærbar og effektiv løsning. Ved hjælp af vokstrykt mikrofluidisk papirbaseret teknologi kvantificerer denne enhed NS1 med høj følsomhed og specificitet gennem billedbehandling. For yderligere at forbedre dens anvendelighed har vi udviklet en brugervenlig smartphone-app til kolorimetrisk og kvantitativ aflæsning. Klinisk validering ved hjælp af patientprøver fra thailandske hospitaler understreger dens umiddelbare indvirkning på patientvurdering i realtid. Vores innovation markerer et afgørende fremskridt inden for strømlinet point-of-care-denguefeberstyring, der lover at revolutionere diagnostik i ressourcebegrænsede sundhedslandskaber.
Et af de vigtige designparametre for et smartphone-baseret læsersystem er evnen til at levere reproducerbar billedbehandling af prøver. I denne undersøgelse blev billederne for enkelhed og bekvemmelighed taget fra tre forskellige smartphone-mærker med 12-13 MP-kameraer uden brug af en billedboks eller tilbehør. Variable betingelser for billedoptagelse, såsom kameraets opløsning, billedoptagelsestid, lysforhold og miljø, kan påvirke farveintensiteten af test- og kontrolpunkterne på enheden. Virkningen af forskel…
The authors have nothing to disclose.
MHP anerkender taknemmeligt stipendieforskningsfonden fra Universitas Islam Indonesia (UII). Forfatterne udtrykker deres taknemmelighed til Mr. Nutchanon Ninyawee for hans værdifulde ekspertise og hjælp gennem hele udviklingen af mobilapplikationen og hans bidrag til manuskriptet. Desuden sætter forfatterne pris på den økonomiske støtte fra Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (projektnr. FRB660073/0164) under Program Smart Healthcare of King Mongkut’s University of Technology Thonburi.
Materials | |||
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
Casein | Merck | 9005-46-3 | |
Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
Double tape side | Stationery shops | ||
Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
Instruments | |||
CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
Oven | Memmert | ||
Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
Software | |||
Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
Inkscape 0.91 Software |