뎅기열 NS1 항원의 비색 및 정량적 검출을 위해 스마트폰 애플리케이션과 결합된 휴대용 종이 기반 면역분석
Summary
긴급한 뎅기열 진단 요구 사항을 해결하기 위해 임상 혈청/혈액 샘플에서 뎅기열 NS1 항원 농도를 정량화하기 위한 스마트폰 앱 통합 뎅기열 NS1 종이 기반 분석 장치(DEN-NS1-PAD)를 소개합니다. 이 혁신은 자원이 제한된 환경에서도 다양한 의료 환경에서 임상적 의사 결정을 지원함으로써 뎅기열 관리를 향상시킵니다.
Abstract
흰줄숲모기에 의해 전염되는 뎅기열 바이러스(DENV) 감염은 열대 및 아열대 국가에서 주요 공중 보건 문제입니다. 연간 약 1,000만 명의 환자가 발생하고 20,000-25,000명이 사망하는 상황에서, 특히 어린이들 사이에서 실용적인 진단 도구가 시급히 필요합니다. 초기 감염 시 뎅기열 비구조 단백질 1(NS1)의 존재는 사이토카인 방출, 혈관 누출 및 내피 기능 장애와 관련이 있어 중증 뎅기열의 잠재적 표지자가 될 수 있습니다.
측면 유동 분석(LFA) 및 미세유체 종이 기반 분석 장치(PAD)와 같은 종이 기반 면역분석법은 단순성, 신속성, 저렴성, 특이성 및 해석 용이성으로 인해 진단 테스트로 인기를 얻고 있습니다. 그러나 뎅기열 NS1 검출을 위한 기존의 종이 기반 면역분석법은 일반적으로 육안 검사에 의존하여 정성적 결과만 산출합니다. 이러한 한계를 해결하고 감도를 향상시키기 위해 스마트폰 애플리케이션을 비색 및 정량 판독기로 통합하는 종이 기반 분석 장치(PAD), 즉 DEN-NS1-PAD에서 휴대성이 뛰어난 NS1 뎅기열 검출 분석을 제안했습니다. 개발 시스템을 통해 임상 샘플에서 NS1 농도를 직접 정량화할 수 있습니다.
환자로부터 얻은 혈청 및 혈액 샘플을 사용하여 시스템 프로토타입 성능을 시연했습니다. 결과는 즉시 얻어졌으며 시설이 잘 갖춰진 의료 시설과 자원이 제한된 환경 모두에서 임상 평가에 사용할 수 있습니다. 종이 기반 면역분석법과 스마트폰 애플리케이션의 혁신적인 조합은 뎅기열 NS1 항원의 향상된 검출 및 정량화를 위한 유망한 접근 방식을 제공합니다. 육안의 능력을 넘어 감도를 높임으로써 이 시스템은 특히 외딴 지역이나 소외된 지역에서 뎅기열 관리의 임상적 의사 결정을 개선할 수 있는 큰 잠재력을 가지고 있습니다.
Introduction
뎅기열 바이러스(DENV) 감염은 가장 빠르게 퍼지는 모기 매개 질병1이며, 전 세계적으로 3억 9천만 명 이상이 9,600만 건의 증상 감염, 200만 건의 중증 질환 사례에 감염되어 있으며, 매년 25,000명 이상이 사망하고있습니다 1,2. 세계보건기구(WHO)에 따르면 약 39억 명이 뎅기열에 걸릴 위험이 있습니다. ~70%는 아시아 태평양 국가와 주로 동남아시아에 거주합니다3. 2019년 WHO에 보고된 뎅기열 발병 건수는 420만 건이며, 태국은 뎅기열 감염으로 최소 136,000건의 뎅기열 발병과 144건의 사망 사례에 기여했다4. 태국의 뎅기열 발병은 4월부터 12월까지 우기에 도시와 농촌 지역, 특히 북동부 지역에서 발생합니다.
DENV 감염은 무증상 증상인 경증 뎅기열(DF)에서 중증 뎅기 출혈열(DHF)에 이르기까지 다양한 임상 증상을 보입니다. 중증 DHF 질환의 주요 특징은 혈관 투과성 증가에 이어 쇼크와 장기 기능 장애가 뒤따른다1. 혈관 누출을 유발할 수 있는 분자 경로를 이해하는 것은 효과적인 뎅기열 치료법을 개발하는 데 매우 중요합니다. 뎅기열 비구조적 단백질 1(NS1)은 초기 바이러스 감염 시 분비되는 당단백질(glycoprotein)이다 5,6 바이러스 RNA 복제를 위한 보조인자(cofactor)로 기능한다7. NS1은 사이토카인 방출을 유발하고 톨 유사 수용체 4(TLR4) 및 내피 당칼릭스 8,9에 결합하여 혈관 누출에 기여할 수 있습니다. 체외 연구에 따르면 NS1은 내피 세포와 상호 작용하여 세포 사멸을 유도합니다. 이 상태는 내피 기능 장애와 혈관 누출의 원인이 될 수 있다10. 혈청 인터루킨(IL)-10 수치와 상관관계가 있는 NS1 항원 수치는 중증 임상질환 환자에서 유의하게 증가했다11. 뎅기열 NS1은 또한 IL-10을 유도하고 DENV 특이적 T 세포 반응을 억제하여 질병 발병에 기여합니다12,13. 또한 뎅기열 NS1 단백질은 중증 임상질환과 관련이 있었으며, 발병 후 첫 3일 동안 NS1 > 600ng mL-1의 농도는 DHF14의 발병과 관련이 있었다.
DHF 환자에서 뎅기열 NS1 항원의 지속성은 중증 뎅기열6의 표지자로 사용될 수 있습니다. 임상 샘플에서 NS1을 검출하는 방법에는 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 및 신속 검사15와 같은 여러 가지가 있습니다. 임상 환경에서 NS1 단백질의 농도를 측정하기 위한 황금 표준은 ELISA 분석법입니다. 그러나 ELISA 방법은 비용이 많이 들고 숙련된 인력과 실험실 시설이 필요합니다16. 따라서 현장 검사(POCT)에서 NS1 단백질을 검출하고 정량화하는 기술 개발은 여전히 진행 중입니다. 지난 10년 동안 측면 유동 분석법(LFA) 및 미세유체 종이 기반 분석 장치(μPAD)와 같은 종이 기반 면역분석법은 단순성, 신속성, 저렴성 및 특이성으로 인해 진단 검사로 인기를 얻었습니다 17,18,19. 종이 기반 면역분석에서는 금 나노 입자 (AuNP) 20, 자성 나노 입자21,22, 양자점23 및 형광 물질24,25와 같은 여러 표지가 신호를 생성하는 데 사용되었습니다. AuNP는 저렴한 생산 비용, 제조 용이성, 안정성 및 간단한 판독으로 인해 종이 기반 면역분석에 사용되는 가장 일반적인 라벨입니다. 현재 뎅기열 NS1에 대한 측면 유동 분석(LFA)은 임상 환경에서 널리 사용되고 있습니다26,27. 그러나 기존의 LFA 라벨 검출은 일반적으로 육안을 사용하며 정성적 결과만 제공합니다.
지난 10년 동안 전 세계적으로 50억 대 이상의 스마트폰이 널리 사용되었으며 휴대용 감지 기능을 개발할 가능성이 있습니다28,29. 스마트폰은 내장형 물리적 센서, 멀티코어 프로세서, 디지털 카메라, USB 포트, 오디오 포트, 무선 및 응용 소프트웨어와 같은 다기능 용량을 갖기 때문에 다양한 바이오센서 플랫폼(30)에서 사용하기에 적합하다. 또한, 무선 기술을 통해 데이터를 신속하게 전송할 수 있으며 실시간 및 현장 모니터링에 사용할 수 있습니다(31). Mudanyali et al.은 종이 기반 면역분석법과 스마트폰을 결합하여 말라리아, 결핵 및 HIV32에 대한 휴대용, 장비가 필요 없고 빠르고, 저렴하고, 사용자 친화적인 POCT 플랫폼을 개발했습니다. Ling et al.은 우유에서 알칼리성 인산가수분해효소 활성을 정량적으로 검출하기 위해 스마트폰 카메라와 결합된 측면 유동 분석을 보고했습니다33. Hou et al.은 또한 측면 유동 분석에서 색상 또는 형광의 정량적 신호에 대한 스마트폰 기반의 이중 양식 이미징 시스템을 개발했습니다(34). 또한, 스마트폰을 비색 및 정량 판독기로서 사용하는 것은 감도를 향상시킬 수 있는 반면, 육안으로는 표적(35)의 존재를 자신 있게 보고할 수 없다.
뎅기열 진단의 돌파구를 제시하는 DEN-NS1-PAD 36,37,38(이하 장치라고 함)은 휴대가 간편하고 효율적인 솔루션을 제공합니다. 왁스 프린팅 미세유체 종이 기반 기술을 사용하는 이 장치는 이미지 처리를 통해 높은 감도와 특이성으로 NS1을 정량화합니다. 그 유용성을 더욱 향상시키기 위해 우리는 비색 및 정량 판독을 위한 사용자 친화적인 스마트폰 앱을 개발했습니다. 태국 병원의 환자 샘플을 사용한 임상 검증은 실시간 환자 평가에 대한 즉각적인 영향을 강조합니다. 당사의 혁신은 간소화된 현장 진료 뎅기열 관리의 중추적인 발전을 의미하며, 자원이 제한된 의료 환경에서 진단에 혁명을 일으킬 것을 약속합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
스마트폰 기반 리더 시스템의 중요한 설계 파라미터 중 하나는 샘플의 재현 가능한 이미징 처리를 제공하는 기능입니다. 이 연구에서는 단순성과 편의를 위해 이미징 박스나 액세서리를 사용하지 않고 12-13MP 카메라가 장착된 세 가지 스마트폰 브랜드에서 이미지를 캡처했습니다. 카메라의 해상도, 이미지 캡처 시간, 조명 조건 및 환경과 같은 이미지 캡처의 다양한 조건은 장치의 테스트 및 제어 …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MHP는 Universitas Islam Indonesia (UII)의 장학금 연구 기금에 감사드립니다. 저자들은 모바일 애플리케이션 개발 전반에 걸쳐 귀중한 전문 지식과 도움을 주고 원고에 기여한 Mr. Nutchanon Ninyawee에게 감사를 표합니다. 또한 저자들은 태국 과학 연구 및 혁신(TSRI), 기초 연구 기금: 2023 회계연도(프로젝트 번호. FRB660073/0164) King Mongkut’s University of Technology Thonburi의 프로그램 Smart Healthcare에 따라.
Materials
| Materials | |||
| 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
| BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
| Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
| Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
| Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
| Casein | Merck | 9005-46-3 | |
| Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
| Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
| Double tape side | Stationery shops | ||
| Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
| Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
| Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
| NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
| PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
| Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
| Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
| Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
| Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
| Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
| Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
| Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
| Instruments | |||
| CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
| Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
| Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
| Oven | Memmert | ||
| Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
| Software | |||
| Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
| ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
| Inkscape 0.91 Software |
References
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