För att ta itu med brådskande behov av denguediagnostik introducerar vi här en smartphone-app-integrerad Dengue NS1 Paper-based Analytical Device (DEN-NS1-PAD) för kvantifiering av Dengue NS1-antigenkoncentration i kliniska serum-/blodprover. Denna innovation förbättrar hanteringen av denguefeber genom att underlätta kliniskt beslutsfattande i olika vårdmiljöer, även resursbegränsade sådana.
Denguevirusinfektion (DENV), som överförs av Aedes-myggor , är ett stort folkhälsoproblem i tropiska och subtropiska länder. Med en årlig incidens på cirka 10 miljoner fall och 20 000-25 000 dödsfall, särskilt bland barn, finns det ett akut behov av praktiska diagnostiska verktyg. Förekomsten av icke-strukturellt dengueprotein 1 (NS1) under tidig infektion har kopplats till cytokinfrisättning, vaskulärt läckage och endoteldysfunktion, vilket gör det till en potentiell markör för svår dengue.
Pappersbaserade immunanalyser som laterala flödesanalyser (LFA) och mikrofluidiska pappersbaserade analysanordningar (PAD) har vunnit popularitet som diagnostiska tester på grund av deras enkelhet, snabbhet, billighet, specificitet och enkla tolkning. Konventionella pappersbaserade immunanalyser för detektion av NS1 i denguefeber förlitar sig dock vanligtvis på visuell inspektion och ger endast kvalitativa resultat. För att ta itu med denna begränsning och förbättra känsligheten föreslog vi en mycket portabel NS1-detektionsanalys av denguefeber på en pappersbaserad analysenhet (PAD), nämligen DEN-NS1-PAD, som integrerar en smartphone-applikation som en kolorimetrisk och kvantitativ läsare. Utvecklingssystemet möjliggör direkt kvantifiering av NS1-koncentrationer i kliniska prover.
Serum- och blodprover från patienter användes för att demonstrera systemprototypens prestanda. Resultaten erhölls omedelbart och kan användas för klinisk bedömning, både i välutrustade vårdinrättningar och i resursbegränsade miljöer. Denna innovativa kombination av en pappersbaserad immunanalys med en smartphone-applikation erbjuder ett lovande tillvägagångssätt för förbättrad detektion och kvantifiering av NS1-dengueantigen. Genom att öka känsligheten bortom blotta ögats kapacitet har detta system stor potential för att förbättra det kliniska beslutsfattandet vid hantering av denguefeber, särskilt i avlägsna eller underbetjänade områden.
Denguevirusinfektion (DENV) är den myggburnasjukdomen som sprids snabbast 1, och mer än 390 miljoner människor är infekterade med 96 miljoner symtomatiska infektioner, 2 miljoner fall av allvarlig sjukdom och mer än 25 000 dödsfall per år inträffar i världen 1,2. Enligt Världshälsoorganisationen (WHO) är uppskattningsvis 3,9 miljarder människor i riskzonen för denguefeber. ~70% bor i länder i Asien och Stillahavsområdet och främst i Sydostasien3. År 2019 rapporterades 4,2 miljoner fall av denguefeber till WHO, och Thailand bidrog med minst 136 000 fall av denguefeber och 144 dödsfall till följd av dengueinfektion4. Dengueutbrottet i Thailand sker under regnperioden, från april till december, i både stads- och landsbygdsområden, särskilt i det nordöstra området.
DENV-infektioner har olika kliniska manifestationer som sträcker sig från subkliniska symtom, mild denguefeber (DF) till svår dengue hemorragisk feber (DHF). Det huvudsakliga kännetecknet för allvarligt DHF-tillstånd är ökad vaskulär permeabilitet följt av chock och organdysfunktion1. Att förstå den molekylära vägen som kan orsaka kärlläckage är mycket viktigt för att utveckla effektiva denguebehandlingar. Dengue icke-strukturellt protein 1 (NS1) är ett utsöndrat glykoprotein under tidig virusinfektion 5,6, och det fungerar som en kofaktor för viral RNA-replikation7. NS1 kan utlösa cytokinfrisättning och bidra till vaskulärt läckage genom att binda till toll-like receptor 4 (TLR4) och endotelglykokalyx 8,9. In vitro-forskning har visat att NS1 interagerar med endotelceller och inducerar apoptos. Detta tillstånd kan bidra till endoteldysfunktion och vaskulärt läckage10. NS1-antigennivåer, korrelerade med serumnivåer av interleukin (IL)-10, ökade signifikant hos patienter med svår klinisk sjukdom11. Dengue NS1 bidrar också till sjukdomspatogenesen genom att inducera IL-10 och undertrycka DENV-specifika T-cellssvar12,13. Dessutom var NS1-proteinet denguefeber relaterat till svår klinisk sjukdom, och koncentrationen av NS1 > 600 ng ml-1 under de första 3 dagarna av sjukdomen var associerad med utvecklingen av DHF14.
Persistensen av dengue NS1-antigenet hos patienter med DHF kan användas som en markör för svår dengue6. Det finns flera metoder för att detektera NS1 i kliniska prover, t.ex. enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA) och snabbtest15. Guldstandarden för att mäta koncentrationen av NS1-proteiner i en klinisk miljö är ELISA-metoden. ELISA-metoden är dock dyr och kräver kvalificerad personal och laboratorieutrustning16. Därför pågår fortfarande utvecklingen av teknik för att detektera och kvantifiera NS1-proteiner i patientnära test (POCT). Under det senaste decenniet har pappersbaserade immunanalyser som laterala flödesanalyser (LFA) och mikrofluidiska pappersbaserade analysanordningar (μPAD) blivit populära som diagnostiska tester på grund av deras enkelhet, snabbhet, billighet och specificitet 17,18,19. I en pappersbaserad immunanalys har flera etiketter använts för att generera signaler, såsom guldnanopartiklar (AuNPs)20, magnetiska nanopartiklar21,22, kvantprickar23 och fluorescensmaterial24,25. AuNP är de vanligaste etiketterna som används i pappersbaserade immunanalyser på grund av deras billiga produktionskostnad, enkla tillverkning, stabilitet och enkla avläsning. För närvarande används laterala flödesanalyser (LFA) för dengue NS1 i den kliniska miljön26,27. Konventionell LFA-etikettdetektering använder dock vanligtvis blotta ögat och ger endast kvalitativa resultat.
Under det senaste decenniet har mer än 5 miljarder smartphones använts i stor utsträckning globalt, och det finns potential för att utveckla bärbar detektering 28,29. Smartphones har multifunktionell kapacitet som inbyggda fysiska sensorer, flerkärniga processorer, digitalkameror, USB-portar, ljudportar, trådlös och applikationsprogramvara, vilket gör dem lämpliga för användning i olika biosensorplattformar30. Dessutom gör trådlös teknik det möjligt att skicka data snabbt och kan användas för övervakning i realtid och på plats31. Mudanyali et al. kombinerade den pappersbaserade immunanalysen och smartphones för att utveckla en bärbar, utrustningsfri, snabb, billig och användarvänlig POCT-plattform för malaria, tuberkulos och HIV32. Ling et al. rapporterade en lateral flödesanalys i kombination med en smartphonekamera för att kvantitativt detektera alkalisk fosfatasaktivitet i mjölk33. Hou et al. utvecklade också ett smartphone-baserat, dual-modality imaging system för kvantitativa signaler från färg eller fluorescens i den laterala flödesanalysen34. Att använda smarttelefonen som en kolorimetrisk och kvantitativ läsare kan dessutom förbättra känsligheten medan blotta ögat inte med säkerhet kan rapportera närvaron av målet35.
DEN-NS1-PAD 36,37,38 (hädanefter kallad enheten) är ett genombrott inom denguediagnostik och erbjuder en bärbar och effektiv lösning. Med hjälp av vaxtryckt mikrofluidisk pappersbaserad teknik kvantifierar denna enhet NS1 med hög känslighet och specificitet genom bildbehandling. För att ytterligare förbättra dess användbarhet har vi utvecklat en användarvänlig smartphone-app för kolorimetrisk och kvantitativ avläsning. Klinisk validering med hjälp av patientprover från thailändska sjukhus understryker dess omedelbara inverkan på patientbedömning i realtid. Vår innovation markerar ett avgörande framsteg inom strömlinjeformad, patientnära denguehantering, och lovar att revolutionera diagnostiken i resursbegränsade vårdlandskap.
En av de viktiga designparametrarna för ett smartphone-baserat läsarsystem är förmågan att tillhandahålla reproducerbar bildbehandling av prover. I den här studien togs bilderna från tre olika smartphone-märken med 12-13 MP-kameror utan att använda en bildbox eller tillbehör. Varierande förhållanden för bildtagning, såsom kamerans upplösning, bildtagningstid, ljusförhållanden och miljö, kan påverka färgintensiteten på test- och kontrollpunkterna på enheten. Effekten av olika bildtagningstider på b…
The authors have nothing to disclose.
M.H.P. är tacksamma för stipendieforskningsfonden från Universitas Islam Indonesia (UII). Författarna uttrycker sin tacksamhet till Mr. Nutchanon Ninyawee för hans värdefulla expertis och hjälp under utvecklingen av mobilapplikationen och hans bidrag till manuskriptet. Dessutom uppskattar författarna det ekonomiska stödet från Thailand Science Research and Innovation (TSRI), Basic Research Fund: Fiscal year 2023 (projekt nr. FRB660073/0164) under Program Smart Healthcare vid King Mongkuts tekniska universitet Thonburi.
Materials | |||
0.1 M phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) | |||
BBS containing 0.1% Tween 20, 10% sucrose, and 1% casein | the conjugate area treatment and blocking buffer | ||
Borate buffered saline (BBS) (25 mM sodium borate and 150 mM sodium chloride at pH 8.2) supplemented with 1% BSA | the washing buffer during the conjugation process AuNPs with the antibody | ||
Boric acid | Merck | 10043-35-3 | |
Bovine serum albumin fraction V (BSA) | PAA Lab GmbH (Germany) | K41-001 | |
Casein | Merck | 9005-46-3 | |
Chromatography paper Grade 2 | GE Healthcare | 3002-911 | |
Clear laminate film | 3M (Stationery shops) | ||
Disodium hydrogen phosphate | Merck | 7558-79-4 | |
Double tape side | Stationery shops | ||
Goat anti-mouse IgG antibody | MyBiosource (USA) | MBS435013 | |
Gold nanoparticles (40 nm) | Serve Science Co., Ltd. (Thailand) | ||
Human IgG polyclonal antibody | Merck | AG711-M | |
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834415 | |
Mouse dengue NS1 monoclonal antibody | MyBiosource (USA) | MBS834236 | |
NS1 serotype 2 antigens | MyBiosource (USA) | MBS 568697 | |
PBS 1X containing 0.1% Tween 20 was used as t | elution buffer | ||
Plastic backing card 10×30 cm | Pacific Biotech Co., Ltd. (Thailand) | ||
Poly-L-lysine (PLL) | Sigma Aldrich | P4832 | |
Potassium Chloride | Merck | 104936 | |
Potassium monophosphate | Merck | 104877 | |
Sodium Chloride | Merck | 7647-14-5 | |
Sodium tetraborate | Sigma Aldrich | 1303-96-4 | |
Sucrose | Merck | 57-50-1 | |
Tween 20 | Sigma Aldrich | 9005-64-5 | |
Instruments | |||
CytationTM 5 multimode reader | BioTek | ||
Mobile phones | Huawei Y7, iPhone 11, Samsung a20 | ||
Photo scanner | Epson Perfection V30 | ||
Oven | Memmert | ||
Wax printer | Xerox ColorQube 8880-PS | ||
Software | |||
Could AutoML Vision Object Detection documentation | Google Cloud | ||
ImageJ | National Institute of Health, Bethesda, MD, USA | ||
Inkscape 0.91 Software |