Epon Post Embedding Korrelativ Ljus och Elektronmikroskopi
Summary
Vi presenterar ett detaljerat protokoll för Epon post-embedding korrelativ ljus- och elektronmikroskopi med hjälp av ett fluorescerande protein som kallas mScarlet. Denna metod kan bibehålla fluorescensen och ultrastrukturen samtidigt. Denna teknik är mottaglig för en mängd olika biologiska tillämpningar.
Abstract
Korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM) är en omfattande mikroskopi som kombinerar lokaliseringsinformationen från fluorescensmikroskopi (FM) och kontexten för cellulär ultrastruktur som förvärvats med elektronmikroskopi (EM). CLEM är en avvägning mellan fluorescens och ultrastruktur, och vanligtvis kompromissar ultrastruktur fluorescens. Jämfört med andra hydrofila inbäddningshartser, såsom glycidylmetakrylat, HM20 eller K4M, är Epon överlägsen när det gäller ultrastrukturbevarande och sektioneringsegenskaper. Tidigare har vi visat att mEosEM kan överleva osmiumtetroxidfixering och eponinbäddning. Med hjälp av mEosEM uppnådde vi för första gången Epon post embedding CLEM, som bibehåller fluorescensen och ultrastrukturen samtidigt. Här ger vi steg-för-steg-detaljer om EM-provberedningen, FM-avbildningen, EM-avbildningen och bildjusteringen. Vi förbättrar också procedurerna för att identifiera samma cell som avbildats med FM-avbildning under EM-avbildningen och detaljerar registreringen mellan FM- och EM-bilderna. Vi tror att man enkelt kan uppnå Epon efter inbäddning av korrelativ ljus- och elektronmikroskopi genom att följa detta nya protokoll i traditionella EM-anläggningar.
Introduction
Fluorescensmikroskopi (FM) kan användas för att erhålla lokalisering och distribution av målproteinet. Sammanhanget som omger målproteinet går dock förlorat, vilket är avgörande för att kunna undersöka målproteinet grundligt. Elektronmikroskopi (EM) har den högsta bildupplösningen och ger flera subcellulära detaljer. EM saknar dock målmärkning. Genom att noggrant sammanfoga fluorescensbilden som tagits av FM med den grå bilden som tagits av EM kan korrelativ ljus- och elektronmikroskopi (CLEM) kombinera informationen som erhålls av dessa två avbildningslägen 1,2,3,4.
CLEM är en avvägning mellan fluorescens och ultrastruktur1. På grund av begränsningarna hos nuvarande fluorescerande proteiner och de traditionella EM-provberedningsprocedurerna, särskilt användningen av osmisk syra (OsO4) och hydrofoba hartser som Epon, äventyrar ultrastrukturen alltid fluorescens5. OsO4 är ett oumbärligt reagens vid EM-provberedning, som används för att förbättra kontrasten i EM-bilder. Jämfört med andra inbäddningshartser är Epon överlägsen när det gäller ultrastrukturbevarande och sektioneringsegenskaper5. Inga fluorescerande proteiner kan dock behålla fluorescenssignalen efter behandling med OsO4 och Epon embedding6. För att övervinna begränsningarna hos fluorescerande proteiner utvecklades pre embedding CLEM, där FM-avbildning görs före EM-provberedning6. Nackdelen med förinbäddning av CLEM är dock den oprecisa registreringen mellan FM- och EM-bilderna5.
Tvärtom utför CLEM-metoden efter inbäddning FM-avbildningen efter EM-provberedningen, vars registreringsnoggrannhet kan nå 6-7 nm 5,6. För att bibehålla fluorescensen hos fluorescerande proteiner har mycket låga koncentrationer av OsO4 (0,001%)3 eller EM-preparationsmetoderna 4,7 med fryst under högt tryck (HPF) och fryssubstitution (FS) använts på bekostnad av komprometterad ultrastruktur eller kontrasten i EM-bilden. Utvecklingen av mEos4b främjar i hög grad framstegen med CLEM efter inbäddning, även om glycidylmetakrylat används som inbäddningsharts5. Med utvecklingen av mEosEM, som kan överleva OsO4-färgning och Epon-inbäddning, uppnåddes Epon för första gången med superupplösning CLEM efter inbäddning, vilket bibehöll fluorescensen och ultrastrukturen samtidigt6. Efter mEosEM utvecklades flera fluorescerande proteiner som kan överleva OsO4-färgningen och Epon-inbäddningen 8,9,10,11. Detta främjar i hög grad utvecklingen av CLEM.
Det finns tre viktiga aspekter av Epon efter inbäddning av CLEM. Det första är det fluorescerande proteinet, som ska bibehålla den fluorescerande signalen efter EM-provberedning. Enligt vår erfarenhet är mScarlet överlägset andra rapporterade fluorescerande proteiner. Den andra är hur man hittar samma cell avbildad med FM-avbildning i EM-avbildning. För att lösa detta problem förbättrar vi proceduren för detta steg så att man lätt kan hitta målcellen. Den sista är metoden för att justera FM-bilden med EM-bilden. Här beskriver vi registreringen mellan FM- och EM-bilderna. I detta protokoll uttrycker vi mScarlet i VGLUT2-neuroner och visar att mScarlet kan rikta in sig på sekundära lysosomer med hjälp av Epon post-embedding CLEM. Vi tillhandahåller steg-för-steg-detaljer för Epon efter inbäddning av CLEM, utan att kompromissa med fluorescensen och ultrastrukturen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här är en mångsidig avbildningsmetod, som kan kombinera lokaliseringsinformationen för målproteinet från ljusmikroskopi (LM) och kontexten kring målproteinet från elektronmikroskopi (EM)6. Med de begränsningar som nuvarande fluorescerande proteiner har, är den allmänt använda metoden pre-embedding correlative light and electron microscopy (CLEM), vilket innebär att LM-avbildningen görs före EM-provberedningen. Nästan alla existerande fluorescerande prote…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta projekt stöddes av National Natural Science Foundation of China (32201235 till Zhifei Fu), Natural Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (2022J01287 till Zhifei Fu), Research Foundation for Advanced Talents vid Fujian Medical University, Kina (XRCZX2021013 till Zhifei Fu), Finance Special Science Foundation of Fujian-provinsen, Kina (22SCZZX002 till Zhifei Fu), Grundandet av NHC Key Laboratory of Technical Evaluation of Fertility Regulation for Non-human Primate, och Fujian Maternity and Child Health Hospital (2022-NHP-04 till Zhifei Fu). Vi tackar Linying Zhou, Minxia Wu, Xi Lin och Yan Hu vid Public Technology Service Center, Fujian Medical University för stöd med EM-provberedning och EM-avbildning.
Materials
| 0.2 M Phosphate Buffer (PB) | NaH2PO4 · 2H2O+Na2HPO4 · 12H2O | ||
| 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5) | Shanghai yuanye Bio-Technology | R26284 | |
| 25% Glutaraldehyde (GA) | Alfa Aesar | A17876 | Hazardous chemical |
| Abbelight 3D | Nanolnsights | ||
| Acetone | SCR | 10000418 | |
| Ammonium hydroxide | J&K Scientific | 335213 | |
| BioPhotometer D30 | eppendorf | ||
| Cleaning buffer of cover glasses | 50 mL Ammonium hydroxide, 50 mL Hydrogen peroxide, 250 mL H2O | ||
| Coverglass | Warner | 64-0715 | |
| DABCO | Sigma | 290734 | Hazardous chemical |
| DDSA | SPI company | GS02827 | Hazardous chemical |
| Desktop centrifuge | WIGGENS | MINICEN 10E | |
| Diamond knife | DiATOME | MX6353 | |
| DMP-30 | SPI company | GS02823 | Hazardous chemical |
| DNA transfection reagent | Thermo Fisher | 2696953 | Lipofectamine 3000 Transfection Kit |
| Epon 812 | SPI company | GS02659 | Hazardous chemical |
| Ethanol | SCR | 10009218 | |
| Fiji image J | National Institutes of Health | ||
| Fixative solution | 4% PFA+0.25% GA+0.02 M PB | ||
| Formvar | Sigma | 9823 | |
| Glycerol | SCR | 10010618 | |
| Gold nanoparticles | Corpuscular | 790120-010 | |
| Gradient resin | Acetone to resin 3:1, 1:1, 1:3 | ||
| Hydrofluoric acid | SCR | 10011118 | |
| Hydrogen peroxide | SCR | 10011218 | |
| ICY (https://icy.bioimageanalysis.org/about/) | Easy CLEMv0 Plugin | ||
| Imaging chamber | Thermo Fisher | A7816 | |
| Large gelatin capsules | Electron Microscopy Sciences | 70117 | |
| Mounting buffer | Mowiol 4-88, Glycerol, 0.2 M Tris-Cl (pH 8.5), DABCO | ||
| Mowiol 4-88 | Sigma | 9002-89-5 | |
| Na2HPO4 ž12H2O | SCR | 10020318 | |
| NaH2PO4 ž2H2O | SCR | 20040718 | |
| NMA | SPI company | GS02828 | Hazardous chemical |
| Oligonucleotide primers | Takara Biomedical Technology (Beijing) | Three oligonucleotides primers were used to detect Vglut2-ires-Cre and wild-type simultaneously. The primers 5,-ATCGACCGGTAATGCAGGCAA-3, and 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, aimed to detect Vglut2-ires-Cre. The primers 5,-CGGTACCACCAAATCTTACGG-3, and 5,-CATGGTCTGTTTTGAATTCAG-3, aimed to detect wild-type. | |
| Oscillating microtome | Leica | VT1000S | |
| Osmium tetroxide | SCR | L01210302 | Hazardous chemical |
| OsO4 solution | 1% Osmium tetroxide+1.5% K4Fe (CN)6·3H2O | ||
| Parafilm | Amcor | PM-996 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | SCR | 80096618 | Hazardous chemical |
| Perfusion buffer | 4% PFA+0.1 M PB | ||
| Pioloform | Sigma | 63148-65-2 | Hazardous chemical |
| Poly-L-lysine | Sigma | 25986-63-0 | |
| Potassium ferrocyanide (K4Fe (CN)6·3H2O) | SCR | 10016818 | |
| Scalpel blades | Merck | S2771 | |
| Scalpel handles | Merck | S2896-1EA | |
| Stereomicroscope | OLYMPUS | MVX10 | |
| Transgenic mice | The Jackson Laboratory | Vglut2-ires-Cre mice (strain: 129S6/SvEvTac) were housed in standard conditions (25 °C, a 12 h light/dark cycle, with water and food given ad libitum. Male and Female mice were used at 2–3 months old, weight range 20-30 g. | |
| Transmission electron microscope (TEM) | FEI | TECNAL G2 | |
| UA solution (2% UA) | Aqueous solution | ||
| Ultramicrotome | Leica | LEICA EM UC6 | |
| Uranyl acetate (UA) | TED PELLA | 19481 | Hazardous chemical |
References
- de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
- Watanabe, S., et al. Protein localization in electron micrographs using fluorescence nanoscopy. Nat Methods. 8 (1), 80-84 (2011).
- Johnson, E., et al. Correlative in-resin super-resolution and electron microscopy using standard fluorescent proteins. Sci Rep. 5 (1), 9583 (2015).
- Paez-Segala, M. G., et al. Fixation-resistant photoactivatable fluorescent proteins for CLEM. Nat Methods. 12 (3), 215-218 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Peng, D., et al. Improved fluorescent proteins for dual-colour post-embedding CLEM. Cells. 11 (7), 1077 (2022).
- Campbell, B. C., Paez-Segala, M. G., Looger, L. L., Petsko, G. A., Liu, C. F. Chemically stable fluorescent proteins for advanced microscopy. Nat Methods. 19 (12), 1612-1621 (2022).
- Tanida, I., et al. Two-color in-resin CLEM of Epon-embedded cells using osmium resistant green and red fluorescent proteins. Sci Rep. 10 (1), 21871 (2020).
- Tanida, I., Kakuta, S., Oliva Trejo, J. A., Uchiyama, Y. Visualization of cytoplasmic organelles via in-resin CLEM using an osmium-resistant far-red protein. Sci Rep. 10 (1), 11314 (2020).
- MacManus, D. B. Excision of whole intact mouse brain. MethodsX. 10, 102246 (2023).
- Lu, X., et al. Preserving extracellular space for high-quality optical and ultrastructural studies of whole mammalian brains. Cell Rep Methods. 3 (7), 24 (2023).
- Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nat Methods. 14 (2), 102-103 (2017).
- Fenno, L. E., et al. Comprehensive dual- and triple-feature intersectional single-vector delivery of diverse functional payloads to cells of behaving mammals. Neuron. 107 (5), 836-853 (2020).
- Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
- Shen, Y., Chen, Y., Wu, J., Shaner, N. C., Campbell, R. E. Engineering of mCherry variants with long Stokes shift, red-shifted fluorescence, and low cytotoxicity. PLoS One. 12 (2), e0171257 (2017).
- Ai, H. W., Olenych, S. G., Wong, P., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Hue-shifted monomeric variants of Clavularia cyan fluorescent protein: identification of the molecular determinants of color and applications in fluorescence imaging. BMC Biol. 6 (13), 1741 (2008).
- Ogoh, K., et al. Dual-color-emitting green fluorescent protein from the sea cactus Cavernularia obesa and its use as a pH indicator for fluorescence microscopy. Luminescence. 28 (4), 582-591 (2013).
- Bindels, D. S., et al. mScarlet: a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging. Nat Methods. 14 (1), 53-56 (2017).
- Xu, P., Xu, T., Zhang, M., Fu, Z., He, W. A protocol for Epon-embedding-based correlative super-resolution light and electron microscopy. Research Square. , (2019).
- Johnson, E., Kaufmann, R. Preserving the photoswitching ability of standard fluorescent proteins for correlative in-resin super-resolution and electron microscopy. Methods Cell Biol. 140, 49-67 (2017).
- Zhou, S., et al. Liquid-liquid phase separation mediates the formation of herpesvirus assembly compartments. J Cell Biol. 222 (1), 17 (2023).
- Tao, C. L., et al. Differentiation and characterization of excitatory and inhibitory synapses by cryo-electron tomography and correlative microscopy. J Neurosci. 38 (6), 1493-1510 (2018).
