माइक्रोमीटर पैमाने पर 3 डी प्रिंटिंग न्यूरोनल सेल संस्कृतियों के लिए बहुलक उपकरणों के तेजी से प्रोटोटाइप को सक्षम बनाता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, न्यूरॉन्स के बीच संरचनात्मक कनेक्शन न्यूराइट आउटग्रोथ को प्रभावित करने वाले अवरोधों और चैनलों को बनाकर विवश थे, जबकि इस तरह के हेरफेर के कार्यात्मक परिणाम बाह्य इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी द्वारा देखे गए थे।
न्यूरोनल संस्कृतियां कई दशकों से एक संदर्भ प्रयोगात्मक मॉडल रही हैं। हालांकि, 3 डी सेल व्यवस्था, न्यूराइट आउटग्रोथ पर स्थानिक बाधाएं, और यथार्थवादी सिनैप्टिक कनेक्टिविटी गायब हैं। उत्तरार्द्ध कम्पार्टमेंटलाइजेशन के संदर्भ में संरचना और कार्य के अध्ययन को सीमित करता है और तंत्रिका विज्ञान में संस्कृतियों के महत्व को कम करता है। पूर्व विवो का अनुमान लगाना सिनैप्टिक कनेक्टिविटी की संरचित शारीरिक व्यवस्था तुच्छ नहीं है, लय, सिनैप्टिक प्लास्टिसिटी और अंततः, मस्तिष्क पैथोफिज़ियोलॉजी के उद्भव के लिए महत्वपूर्ण होने के बावजूद। यहां, दो-फोटॉन पोलीमराइजेशन (2 पीपी) को 3 डी प्रिंटिंग तकनीक के रूप में नियोजित किया जाता है, जो माइक्रोमीटर पैमाने पर पॉलीडिमिथाइल-सिलोक्सेन (पीडीएमएस) का उपयोग करके बहुलक सेल संस्कृति उपकरणों के तेजी से निर्माण को सक्षम करता है। माइक्रोफोटोलिटोग्राफी पर आधारित पारंपरिक प्रतिकृति मोल्डिंग तकनीकों की तुलना में, 2 पीपी माइक्रो-स्केल प्रिंटिंग प्रोटोटाइप के तेजी से और सस्ती बदलाव को सक्षम बनाता है। यह प्रोटोकॉल मॉड्यूलर न्यूरोनल नेटवर्क की खेती के उद्देश्य से पीडीएमएस-आधारित माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों के डिजाइन और निर्माण को दर्शाता है। सिद्धांत के प्रमाण के रूप में, एक दो-कक्ष उपकरण शारीरिक रूप से कनेक्टिविटी को बाधित करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है। विशेष रूप से, पूर्व विवो विकास के दौरान एक असममित अक्षीय प्रकोप का पक्ष लिया जाता है और एक कक्ष से दूसरे कक्ष में निर्देशित होने की अनुमति दी जाती है। यूनिडायरेक्शनल सिनैप्टिक इंटरैक्शन के कार्यात्मक परिणामों की जांच करने के लिए, वाणिज्यिक माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों को परस्पर जुड़े न्यूरोनल मॉड्यूल की बायोइलेक्ट्रिकल गतिविधि की निगरानी के लिए चुना जाता है। यहां, 1) माइक्रोमीटर परिशुद्धता के साथ नए नए साँचे बनाने के तरीके और 2) चूहे कॉर्टिकल न्यूरोनल संस्कृतियों में इन विट्रो मल्टीसाइट बाह्य रिकॉर्डिंग में प्रदर्शन करते हैं। लागत में कमी और 2PP 3D-प्रिंटिंग की भविष्य की व्यापक पहुंच से, यह विधि दुनिया भर में अनुसंधान प्रयोगशालाओं में अधिक से अधिक प्रासंगिक हो जाएगी। विशेष रूप से न्यूरोटेक्नोलॉजी और उच्च-थ्रूपुट तंत्रिका डेटा रिकॉर्डिंग में, इन विट्रो मॉडल में सरलीकृत प्रोटोटाइप की आसानी और कठोरता प्रयोगात्मक नियंत्रण और विवो बड़े पैमाने पर तंत्रिका प्रणालियों की सैद्धांतिक समझ में सुधार करेगी।
जीवों के व्यवहार में न्यूरोनल गतिविधि की जांच करना कई चुनौतियां प्रस्तुत करता है। उदाहरण के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों तक भौतिक पहुंच इसकी अखंडता को बनाए रखने की आवश्यकता से सीमित है, इसलिए मस्तिष्क के सतही क्षेत्रों को अधिक आसानी से माना जाता है। बरकरार ऊतक के भीतर विशिष्ट लक्ष्यों को अलग करना अक्सर एक कठिन काम होता है और कभी-कभी असंभव होता है। यद्यपि अलग-अलग सजातीय न्यूरोनल संस्कृतियां एक तंत्रिका सर्किट के व्यक्तिगत (उप) सेलुलर घटकों के आणविक, जैव रासायनिक और बायोफिजिकल गुणों तक सुविधाजनक पहुंच प्रदान करती हैं, एक यथार्थवादी कनेक्टिविटी और बरकरार मस्तिष्क का शारीरिक संगठन खो जाता है। इन मूलभूत बाधाओं ने एक मध्य जमीन को प्राप्त करने के लिए अनुसंधान प्रयासों को प्रेरित किया, जहां विवो जटिलता से बचा जाता है, जबकि संरचना का निर्माण इन विट्रो में किया जा सकता है, जोमांग पर है 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . विशेष रूप से, मॉड्यूलर न्यूरोनल संस्कृतियां पिछले दशकों में व्यापक शोध का विषय रही हैं, जिसका उद्देश्य नीचे वर्णित मस्तिष्क शरीर विज्ञान के प्रमुख प्रश्नों से निपटना है।
संगठन: विवो अध्ययनों से पता चलता है कि मस्तिष्क को सटीक सेल प्रकारों और अनुमानों के सरणियों के साथ परतों में संरचनात्मक रूप से संरचित किया जाता है। कार्यात्मक assays सटीक कनेक्टिविटी योजनाओं10,11 के साथ, नोड विधानसभाओं और मॉड्यूल में न्यूरोनल नेटवर्क के संगठन का पता चला. कनेक्टिविटी और माइक्रोक्रिकिट रूपांकनों की भूमिका, हालांकि, विवो में पर्याप्त रूप से अध्ययन नहीं किया जा सकता है, जिसमें शामिल सिनैप्स की सरासर संख्या के साथ-साथ विकास और गतिविधि-निर्भर प्लास्टिसिटी के इंटरवॉवन प्रभाव भी शामिल हैं।
संकेत स्थानांतरण: इन विवो या यादृच्छिक इन विट्रो संस्कृतियों में , सिग्नल ट्रांसफर का आकलन करना चुनौतीपूर्ण है। इसकी लंबाई के साथ अक्षीय चालन और कार्रवाई क्षमता की जांच करने के लिए सतह कार्यात्मकता या रासायनिक पैटर्निंग द्वारा न्यूराइट आउटग्रोथ का मार्गदर्शन करने की आवश्यकता होती है, जो विद्युत गतिविधि12 के बाह्य रीडआउट में उच्च सिग्नल-टू-शोर अनुपात प्रदान करता है।
अनुवादीय प्रासंगिकता: पैथोलॉजिकल स्थितियों में पूर्व-बनाम पोस्ट-सिनैप्टिक तत्वों की अनन्य भूमिका को समझने के लिए इन तत्वों तक व्यक्तिगत रूप से पहुंच की आवश्यकता होती है। विवश कनेक्टिविटी के साथ मॉड्यूलर संस्कृतियों, प्रभावी ढंग से पूर्व और बाद synaptic तत्वों को अलग, इस अंत13 के लिए अपरिहार्य उपकरण हैं.
न्यूरोनल संस्कृति में संरचना के कुछ रूप प्राप्त करने के लिए कई तरीके मौजूद हैं। उन्हें मोटे तौर पर रासायनिक और भौतिक सतह हेरफेर 9 के रूप में वर्गीकृत किया जा सकताहै। पूर्व तरीकों14,15 कुछ (जैव) रासायनिक यौगिकों को संलग्न करने के लिए न्यूरोनल कोशिकाओं की प्रवृत्ति पर भरोसा करते हैं. इसके लिए सूक्ष्म पैमाने पर सटीकता के साथ सतह पर चिपकने वाला या आकर्षक अणुओं को जमा करने और एक विस्तृत पैटर्न का पालन करने की आवश्यकता होती है। हालांकि यह वांछित पैटर्न के बाद, कोशिकाओं की सतह के आंशिक कवरेज की अनुमति देता है, रासायनिक तरीकों स्वाभाविक रूप से सीमित हैं और न्यूराइट विकास मार्गदर्शन16 में अपेक्षाकृत कम सफलता दर है. अक्षतंतु दिशात्मकता पर पूर्ण नियंत्रण अक्षीय मार्गदर्शन17 को आकार देने के लिए तदर्थ रसायनों की एक स्थानिक ढाल स्थापित करने की आवश्यकता है. बाद के तरीकों में भौतिक सतह हेरफेर शामिल है और आमतौर पर इन विट्रो में न्यूरोनल नेटवर्क की संरचना के लिए उपयोग किया जाता है। न्यूरोनल कोशिकाओं को ज्यामितीय कारावास, जैसे सूक्ष्म कक्षों, दीवारों, चैनलों, आदि द्वारा वांछित स्थानों पर शारीरिक रूप से विवश किया जाता है, जो पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस)3,5,6,7,18,19,20 जैसे जैव-संगत बहुलक को आकार देते हैं और एक माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में जम जाते हैं। पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन के लिए वास्तविक विधि नरम फोटोलिथोग्राफी21 है, जहां एक दो-आयामी मुखौटा सूक्ष्म पैमाने पर पैटर्न किया जाता है और यूवी एक्सपोजर पर सिलिकॉन-आधारित सामग्री को चुनिंदा रूप से खोदने के लिए नियोजित किया जाता है। संक्षेप में, एक यूवी-इलाज योग्य राल (यानी, फोटोरेसिस्ट) को स्पिन-कोटिंग के माध्यम से एक सिलिकॉन वेफर पर लेपित किया जाता है, जो इसकी चिपचिपाहट और कताई गति द्वारा निर्धारित एक विशिष्ट ऊंचाई तक पहुंचता है। फिर, पैटर्न वाला मुखौटा फोटोरेसिस्ट के ऊपर स्थित होता है और यूवी प्रकाश के संपर्क में आता है। मुखौटा के भीतर पारदर्शी क्षेत्रों, ब्याज के क्षेत्रों के अनुरूप, यूवी प्रकाश photoresist अणुओं के स्थानीयकृत crosslinking प्रेरित करते हैं. अनएक्सपोज़्ड फोटोरेसिस्ट के क्षेत्रों को एक विलायक का उपयोग करके धोया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप एक मास्टर मोल्ड का निर्माण होता है। इसका उपयोग बार-बार पसंद के इलास्टोमर (यानी, पीडीएमएस) को सेंकने के लिए किया जाता है, जिसे बाद में वांछित प्रतिकृतियों में वांछित ज्यामिति के साथ उत्कीर्ण किया जाता है। इस तरह के एक विनिर्माण विधि microfluidic उपकरणों22 fabricate करने के लिए सबसे आम विधि है. शायद नरम फोटोलिथोग्राफी की मुख्य सीमाएं उल्लेखनीय पूंजी निवेश की शर्त और आवश्यक तकनीकों और विशेषज्ञता के साथ जैविक प्रयोगशालाओं की अपरिचितता हैं। मुखौटा की तैयारी और जटिल बहु-ऊंचाई उच्च पहलू अनुपात ज्यामिति डिजाइन करने के लिए आवश्यक नरम फोटोलिथोग्राफी के कदम गैर-तुच्छ23 हैं और अक्सर आउटसोर्सिंग की आवश्यकता होती है। भले ही वैकल्पिक और कम बजट के तरीकों का प्रस्ताव किया गया है, वे हमेशा जैविक प्रोटोटाइप24 की उच्च परिशुद्धता आवश्यकताओं को पूरा नहीं करते हैं।
यहां, एक वैकल्पिक विनिर्माण विधि प्रस्तुत की जाती है, जो दो-फोटॉन पोलीमराइजेशन (2 पीपी) और योजक विनिर्माण पर निर्भर करती है। यह सीधा है और प्रति से उन्नत माइक्रोफैब्रिकेशन और माइक्रोफोटोलिटोग्राफी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है। 2PP micromanufacturing के अनुसंधान क्षेत्र देर से 9025 में उभरा, और तब से, यह घातीय वृद्धि26 देखा गया है. इस तकनीक के मौलिक सिद्धांतों के बारे में अधिक कहीं और पाया जा सकताहै 26. संक्षेप में, तीन आयामी अंतरिक्ष में उत्तेजना प्रकाश आवेग पर ध्यान केंद्रित करके, 2PP तीव्रता पर मल्टीपोटन अवशोषण की nonlinear निर्भरता का लाभ उठाता है. यह सीमित अवशोषण की क्षमता प्रदान करता है, बहुत स्थानीय क्षेत्रों के भीतर सटीक और चयनात्मक उत्तेजना सुनिश्चित करता है। संक्षेप में, एक नकारात्मक टोन photoresist, प्रकाश जोखिम पर कम घुलनशीलता के साथ एक सामग्री, एक कम कर्तव्य चक्र27 पर femtosecond लेजर दालों के एक केंद्रित बीम के अधीन है. यह कम औसत शक्तियों पर उच्च तीव्रता वाले आवेगों के लिए अनुमति देता है, सामग्री को नुकसान पहुंचाए बिना पोलीमराइजेशन को सक्षम करता है। फोटो-प्रेरित कट्टरपंथी मोनोमर्स की बातचीत कट्टरपंथी ओलिगोमर्स को जन्म देती है, पोलीमराइजेशन की शुरुआत करती है जो पूरे फोटोरेसिस्ट में एक अलग मात्रा तक फैली हुई है, अर्थात, वोक्सेल, जिसका आकारलेजर दालों की तीव्रता और अवधि पर निर्भर करता है।
इस काम में, दो घटक प्रस्तुत किए जाते हैं: ए) 3 डी-मुद्रित मोल्ड का डिजाइन और तेजी से निर्माण, डिस्पोजेबल पॉलिमरिक न्यूरोनल सेल कल्चर डिवाइस(चित्रा 1)का उत्पादन करने के लिए कई बार पुन: प्रयोज्य, और बी) प्लानर न्यूरोनल सेल कल्चर सब्सट्रेट की सतह पर उनके यांत्रिक युग्मन, या यहां तक कि सब्सट्रेट-एकीकृत माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणियों में भी बायोइलेक्ट्रिक सिग्नल की मल्टीसाइट रिकॉर्डिंग में सक्षम।
एक 3 डी मैकेनिकल मॉडल के कंप्यूटर असिस्टेड डिज़ाइन को यहां बहुत संक्षेप में वर्णित किया गया है और 3 डी-प्रिंटेड मोल्ड और पीडीएमएस उपकरणों को बनाने के लिए अग्रणी चरणों के साथ भी विस्तृत है।
विभिन्न प्रकार के कंप्यूटर-एडेड डिज़ाइन सॉफ़्टवेयर अनुप्रयोगों का उपयोग शुरुआती 3D ऑब्जेक्ट मॉडल उत्पन्न करने और 2PP प्रिंटिंग प्रक्रिया को नियंत्रित करने के लिए STL फ़ाइल बनाने के लिए किया जा सकता है। सामग्री की तालिका के भीतर, सूचीबद्ध पहले और अंतिम आवेदन नि: शुल्क हैं या मुफ्त लाइसेंस के साथ प्रदान किए गए हैं। एक 3D मॉडल के निर्माण के लिए हमेशा एक 2D स्केच बनाने की आवश्यकता होती है, जिसे बाद के मॉडलिंग चरणों में निकाला जाता है। इस अवधारणा को प्रदर्शित करने के लिए, प्रोटोकॉल अनुभाग में एक सामान्य 3 डी सीएडी सॉफ्टवेयर डिजाइन प्रक्रिया पर प्रकाश डाला गया है, जिससे अतिव्यापी क्यूब्स से बना एक संरचना होती है। अधिक व्यापक जानकारी के लिए, कई ऑनलाइन ट्यूटोरियल और मुफ्त प्रशिक्षण संसाधन उपलब्ध हैं, जैसा कि सामग्री की तालिका में दर्शाया गया है।
परिणामी एसटीएल फ़ाइल को तब 3 डी-प्रिंटर (यानी, स्लाइसिंग प्रक्रिया) द्वारा निष्पादित किए जाने वाले आदेशों की एक श्रृंखला में अनुवादित किया जाता है। उपयोग में आने वाले विशिष्ट 2PP 3D-प्रिंटर के लिए, सॉफ़्टवेयर DeScribe का उपयोग STL फ़ाइल को आयात करने और इसे मालिकाना सामान्य लेखन भाषा (GWL) प्रारूप में बदलने के लिए किया जाता है। 2PP प्रिंटिंग प्रक्रिया की सफलता विभिन्न मापदंडों, विशेष रूप से, लेजर पावर और इसकी स्कैन गति, सिलाई और हैचिंग-स्लाइसिंग दूरी पर टिका है। उद्देश्य और फोटोरेसिस्ट के चयन के साथ इन मापदंडों की पसंद, डिजाइन की सबसे छोटी विशेषताओं के साथ-साथ इच्छित अनुप्रयोग पर निर्भर करती है। इस प्रकार, विभिन्न डिजाइन परिदृश्यों और उपयोग के मामलों की आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए पैरामीटर अनुकूलन आवश्यक हो जाता है। इस काम के लिए, अनुशंसित नुस्खा आईपी-एस 25x आईटीओ शैल (3 डी एमएफ) को मुद्रण मापदंडों के लिए एक कॉन्फ़िगरेशन के रूप में माना गया है। अंततः, एक यंत्रवत् स्थिर मुद्रित भाग को आवश्यक संकल्प के साथ मुद्रित किया जाता है, जबकि इसके 3 डी-प्रिंटिंग समय को कम किया जाता है।
मोल्ड डिजाइन और संबंधित एसटीएल फ़ाइल, इस काम में प्रदर्शित की गई है, जिसमें दो डिब्बों में सेल संस्कृति के स्थान को अलग करने के लिए एक वर्ग फ्रेम शामिल है: एक बाहरी क्षेत्र (यानी, बाद में स्रोत के रूप में संदर्भित) और एक आंतरिक क्षेत्र (यानी, बाद में लक्ष्य के रूप में संदर्भित)। ये दो डिब्बे माइक्रोचैनल्स के सेट के माध्यम से जुड़े हुए हैं, प्रत्येक को तेज-कोण सीमाओं की विशेषता है, जो विशेष रूप से लक्ष्य से स्रोत तक न्यूराइट्स के विकास में बाधा डालने के लिए डिज़ाइन किया गया है, लेकिन इसके विपरीत नहीं, और इस तरह न्यूरॉन्स के बीच एक दिशात्मक सिनैप्टिक कनेक्टिविटी को बढ़ावा देता है दो क्षेत्रों पर बढ़ रहा है।
पहले के अध्ययनों ने न्यूराइट्स के दिशात्मक विकास को प्रोत्साहित करने के लिए माइक्रोचैनल की विभिन्न ज्यामिति को नियोजित किया। उदाहरणों में त्रिकोणीय आकार18, चैनल कांटेदार संरचनाएं19, और टेपिंग चैनल20 शामिल हैं। यहां, माइक्रोचैनल की सीमाओं के पार तेज कोण बाधाओं की विशेषता वाला एक डिज़ाइन नियोजित है, जो असममित प्रवेश द्वारों की विशेषता भी है। ये माइक्रोचैनल एक संलग्न इंटीरियर, लक्ष्य डिब्बे और बाहरी क्षेत्र, स्रोत डिब्बे के बीच निरंतरता स्थापित करने का काम करते हैं। स्रोत पक्ष से माइक्रोचैनल्स के प्रारंभिक भाग का फ़नल आकार, अक्षीय बंडलों के गठन और सबसे कम, यानी सीधी रेखा, स्रोत को लक्ष्य से जोड़ने वाले पथ के साथ उनकी वृद्धि को बढ़ावा देने के लिए डिज़ाइन किया गया है। तेज कोणों का सामना करके महसूस किए गए त्रिकोणीय स्थान में लक्ष्य पक्ष पर बड़ी मात्रा होती है ताकि उपलब्ध स्थान के स्रोत और कब्जे से उत्पन्न होने वाले बंडलों की तेजी से शूटिंग के पक्ष में न्यूराइट्स के पाथफाइंडिंग में प्रभावी ढंग से देरी हो सके। माइक्रोचैनल की लंबाई के लिए 540 माइक्रोन की पसंद प्रभावी रूप से आम तौर पर कम वृक्ष के समान प्रकोप39 को फ़िल्टर करती है। इसके अलावा, उनकी 5 माइक्रोन ऊंचाई सेल सोमाटा को माइक्रोचैनल्स के माध्यम से घुसने से रोकती है। कुल मिलाकर, यह कॉन्फ़िगरेशन बाहरी, स्रोत और आंतरिक, लक्ष्य मॉड्यूल के बीच यूनिडायरेक्शनल कनेक्टिविटी को बढ़ावा देने के लिए साबित हुआ, और इसे यहां कई वैकल्पिक विकल्पों के बीच एक प्रमाण-सिद्धांत के रूप में प्रस्तुत किया गया है।
जबकि पीडीएमएस उपकरणों, 2PP मोल्ड द्वारा निर्मित, इस काम में ग्लास coverslips या पेट्री व्यंजन के रूप में आम सेल संस्कृति सब्सट्रेट, की सतह से जुड़ा जा सकता है, इस काम में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सब्सट्रेट-एकीकृत microelectrode सरणियों का इस्तेमाल किया गया. माइक्रोइलेक्ट्रोड सरणी लेआउट के लिए 3 डी डिजाइन को अनुकूलित करने के लिए कोई प्रयास नहीं किया गया है, और यांत्रिक युग्मन स्टीरियोमाइक्रोस्कोपी मार्गदर्शन के तहत किया गया था, जिसका उद्देश्य केवल सरणी में डिवाइस की स्थिति को लक्षित करना था, जिससे कुछ माइक्रोइलेक्ट्रोड दोनों पक्षों में खुला रह गया, स्रोत और लक्ष्य। यह न्यूरोनल सेल संस्कृतियों में विवश कनेक्टिविटी के कार्यात्मक परिणामों के प्रारंभिक मूल्यांकन को सक्षम बनाता है।
दशकों पुराना होने के बावजूद, माइक्रोमीटर-स्केल पीडीएमएस-आधारित प्रतिकृति मोल्डिंग में 2PP प्रौद्योगिकी का अनुप्रयोग हाल ही में43,44 का विकास है। इस संदर्भ में, इस कार्य को प्रभावी ढंग से पुन: प्रस्तुत करने में उपयोगकर्ताओं की सहायता के लिए नीचे बिंदुओं की एक श्रृंखला पर चर्चा की गई है।
3D मॉडल डिज़ाइन के लिए, सुनिश्चित करें कि मॉडल में छेद या स्व-चौराहे नहीं हैं। STL के रूप में सहेजते समय बाइनरी फ़ाइल स्वरूप को विशेषाधिकार दें, ASCII-एन्कोडेड की तुलना में इसके छोटे फ़ाइल आकार के पदचिह्न के लिए। यह जटिल ज्यामिति वाले डिजाइनों और मिलीलीटर-चौड़ी वस्तुओं के लिए विशेष रूप से फायदेमंद है। बाइनरी एसटीएल फ़ाइलों का उपयोग करने का अर्थ कम सीपीयू लोड भी है, बाद में यांत्रिक भाग को 3 डी-मुद्रित करने की प्रक्रिया में तैयार करना। एसटीएल फ़ाइल के भीतर सुविधाओं के भौतिक आयामों को आयामहीन इकाइयों में दर्शाया गया है। एसटीएल फ़ाइल को पोस्टप्रोसेसिंग के दौरान, इकाइयों को माइक्रोमीटर के रूप में व्याख्या की जाती है। इसलिए, फ़ाइल तैयार करते समय ब्याज की इकाई, यानी माइक्रोमीटर को अपनाने की सिफारिश की जाती है। मुद्रित मॉडल की सटीकता टेसेलेटेड त्रिकोण को अनुमानित करने वाली सतहों की संख्या से निर्धारित होती है। सतहों की अपर्याप्त संख्या के लिए, अवांछित सतह खुरदरापन उभरेगा। बहरहाल, बहुत बड़ी संख्या में सतहों द्वारा अत्यधिक उच्च सटीकता का लक्ष्य उच्च कम्प्यूटेशनल लोड की कीमत पर आता है, जिससे फ़ाइल प्रसंस्करण धीमा हो जाता है।
3 डी प्रिंटिंग के लिए, प्रिंटिंग के दौरान, 3 डी भौतिक वस्तु एक्स-वाई विमान में तेज गैल्वो स्कैनिंग और जेड-दिशा में पीजो गति का उपयोग करके बनाई जाती है। यह किसी भी दिए गए 3 डी वोक्सेल के भीतर फेमटोसेकंड लेजर बीम को केंद्रित करता है। हालांकि, जब मुद्रण संरचनाएं गैल्वो और पीजो के स्थानिक कवरेज रेंज से बड़ी होती हैं, तो ऑब्जेक्ट को प्रोग्रामेटिक रूप से ब्लॉक में विभाजित किया जाना चाहिए। हालांकि यह मिलीमीटर आकार के मुद्रित भागों के लिए एक आवश्यकता है, ब्लॉकों के बीच जंक्शन (अपूर्ण) सिलाई लाइनों से जुड़े हैं। ब्लॉक गिनती का सावधानीपूर्वक अनुकूलन और एक्स, वाई, और जेड दिशाओं में सिलाई लाइनों की नियुक्ति सिलाई लाइनों के साथ अंतिम वस्तु की महत्वपूर्ण ज्यामितीय विशेषताओं को बाधित करने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। बुलबुले विभिन्न कारणों से प्रिंटिंग इंटरफ़ेस पर बन सकते हैं (उदाहरण के लिए, सब्सट्रेट फोटोरेसिस्ट की अशुद्धियों और असमानताओं), और मुद्रित संरचना की गुणवत्ता और अखंडता को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। इसके अलावा, उच्च लेजर शक्ति से उनकी घटना में वृद्धि हो सकती है। मुद्रित भाग की सबसे निचली परत पर लेजर शक्ति को कम करना, बुलबुला गठन की संभावना को कम करेगा। एक ठोस संरचना के रूप में पूरे भाग को प्रिंट करने के विकल्प के रूप में, शेल- और-मचान विधि पर विचार किया जा सकता है। इसमें केवल भाग (खोल) की बाहरी सतह के साथ-साथ इसके भीतर त्रिकोणीय प्रिज्म तत्वों को प्रिंट करना शामिल है। इन तत्वों को क्षैतिज परतों (मचान) द्वारा अलग किया जाता है, जो छोटे जेब में अबहुलक राल को पकड़ते हैं। यह विधि मुद्रण समय को काफी कम कर देती है, विशेष रूप से मिलीमीटर-आकार की संरचनाओं के लिए प्रासंगिक है। हालांकि, गैर-बहुलक राल के रूप में, पूर्ण यांत्रिक स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए पोस्ट-प्रिंटिंग यूवी एक्सपोजर अनिवार्य है, हालांकि मुद्रित भाग के किसी भी विरूपण से बचने के लिए इस कदम को धीरे से किया जाना चाहिए। इलाज के बाद का समय पसंद की राल, भाग की मोटाई और यूवी पावर40 पर निर्भर करता है। इष्टतम परिणामों के लिए, यूवी एक्सपोजर के बाद, फोटोरेसिस्ट की एक बूंद का उपयोग करके और इसके अनुभाग-कट का मूल्यांकन करते हुए, पूर्ण-गहराई से इलाज के लिए आवश्यक समय का अनुमान लगाने के लिए प्रारंभिक परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। सामान्य इलाज अवधि 5 से 20 मिनट के बीच होती है।
पीडीएमएस प्रतिकृति मोल्डिंग के लिए, माइक्रोमीटर-स्केल सुविधाओं के साथ पीडीएमएस डिवाइस का स्वच्छ निर्माण, बिना किसी साफ-कमरे की सुविधाओं के, चुनौतीपूर्ण हो सकता है: वायु-जनित सूक्ष्म कण पीडीएमएस की अत्यधिक चिपकने वाली सतह पर रह सकते हैं और डिवाइस और सब्सट्रेट के बीच की सील में बाधा डाल सकते हैं, या व्यक्तिगत माइक्रोचैनल के अनुभाग को अवरुद्ध कर सकते हैं। एक लामिना का प्रवाह हुड के तहत प्रोटोकॉल कदम प्रदर्शन और लगातार isopropanol के साथ PDMS सतह परिरक्षण काफी संदूषण जोखिम को कम करता है. इलाज का तापमान और इसकी अवधि सीधे पीडीएमएस क्रॉस लिंकिंग और परिणामी भौतिक गुणों को प्रभावित करती है। विशेष रूप से, ठीक पीडीएमएस की चिपचिपाहट एक महत्वपूर्ण कारक है। एक ओर, पीडीएमएस डिवाइस के बीच एक तंग सील की आवश्यकता होती है, और न्यूरोनल सेल संवर्धन (जैसे, एक ग्लास कवरस्लिप या एमईए) के लिए उपयोग की जाने वाली सतह, न्यूराइट्स के पारित होने को प्रभावी ढंग से प्रतिबंधित करने के लिए। दूसरी ओर, पीडीएमएस डिवाइस को सतह से उलटा जुड़ना चाहिए, ताकि डिवाइस को हटाने के बाद नाजुक इन्सुलेट परत एमईए क्षतिग्रस्त न हो। जबकि इलाज के दौरान पीडीएमएस संकोचन होता है और मोल्ड को आगे बढ़ाकर ठीक किया जा सकता है, तापमान और इलाज अंतराल के लिए यहां संकेत दिया गया है कि संकोचन 2%42 से कम होगा और एकल-स्तरित पीडीएमएस उपकरणों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करेगा। कुल मिलाकर, सर्वोत्तम परिणामों के लिए अनुशंसित इलाज तापमान और अवधि मूल्यों का सटीक रूप से पालन करें।
विधि के फायदे और सीमाओं का अवलोकन
मॉड्यूलर तंत्रिका नेटवर्क के प्रयोगात्मक अध्ययन के लिए सूक्ष्म पैमाने पर बहुलक उपकरणों के तेजी से निर्माण के लिए 2-फोटॉन प्रत्यक्ष लेजर लेखन पर आधारित एक तकनीक प्रस्तावित है। सॉफ्ट फोटोलिथोग्राफी के विपरीत, प्रस्तावित दृष्टिकोण के लिए उच्च स्तर की तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकता नहीं है, बशर्ते एक कार्यात्मक 2PP 3D प्रिंटिंग सेटअप सुलभ और परिचालन हो। उल्लेखनीय रूप से, विधि एक ही दिन के भीतर सीएडी-डिज़ाइन किए गए 3 डी मॉडल से एक कार्यात्मक पीडीएमएस डिवाइस तक जाने में सक्षम बनाती है, इस प्रकार अवधारणा से मूर्त प्राप्ति तक एक सीधा और कुशल मार्ग प्रदान करती है। विशेष रूप से, शेल-एंड-मचान प्रिंटिंग मोड का चयन करने से मोल्ड बनाने के लिए आवश्यक समय काफी कम हो जाता है, क्योंकि इसकी मात्रा का केवल एक अंश मुद्रित होता है। मुद्रित घटक के बाद के यूवी-इलाज इसकी यांत्रिक स्थिरता और मजबूती की गारंटी देता है, जैसा कि पीडीएमएस के साथ 50 से अधिक कास्टिंग चक्रों में सत्यापित किया गया है।
पारंपरिक तरीकों की तुलना में, 2PP 3D प्रिंटिंग एक स्पष्ट लाभ का दावा करती है, जो सबसे अधिक स्पष्ट है जब यह एक महत्वपूर्ण पहलू अनुपात, संकल्प आवश्यकताओं की मांग और जटिल त्रि-आयामी ज्यामिति के साथ नए नए साँचे के निर्माण की बात आती है। मानक यूवी लिथोग्राफी का उपयोग कर मास्टर नए नए साँचे का उत्पादन लगभग 200 माइक्रोन की एक प्रतिरोध मोटाई से विवश है. स्पिन-कोटिंग और एक्सपोजर चक्र35, महंगा लीगा (लिथोग्राफी, इलेक्ट्रोप्लेटिंग, और मोल्डिंग), या गहरी प्रतिक्रियाशील आयन नक़्क़ाशी (डीआरआईई) प्रक्रियाओं के जटिल अनुक्रम36 अधिक ऊंचाई और पहलू अनुपात प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। इसके विपरीत, जैसा कि 201037 में कुमी एट अल के अग्रणी काम में दिखाया गया है, 2 पीपी तकनीक मुद्रित भागों के पहलू अनुपात के लिए अनिवार्य रूप से असीम गुंजाइश प्रदान करती है, जो उप-माइक्रोमीटर से मिलीमीटर तक फैली हुई है। यहां, इसके भागों की ऊंचाई में महत्वपूर्ण अंतर के साथ एक मोल्ड की माइक्रोमैनुफैक्चरिंग प्रक्रिया का उदाहरण दिया गया है, जिसमें माइक्रोचैनल्स की ऊंचाई (5 माइक्रोन और अधिकतम मोल्ड की ऊंचाई (545 माइक्रोन; चित्रा 2 देखें) के बीच 100 गुना अंतर है।
इसके अलावा, उप-माइक्रोमीटर रिज़ॉल्यूशन को उल्लिखित प्रोटोकॉल विनिर्देशों का पालन करके आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। इसकी तुलना में, यूवी फोटोलिथोग्राफी के माध्यम से बढ़ाया मोल्ड संकल्प प्राप्त करना पूंजी निवेश की मांग करता है। बेहतरीन संकल्प के साथ मास्क, 600 एनएम के नाममात्र संकल्प पर क्वार्ट्ज पर क्रोमियम जमाव का उपयोग, लेजर मुद्रित ओवरहेड पारदर्शिता मास्क, जो 250 माइक्रोन35 के एक संकल्प के अधिकारी की तुलना में अधिक परिमाण के कई आदेश की कीमत है, हालांकि Pirlo एट अल.41 के काम को देखें. इन-हाउस उपयोग के लिए व्यवहार्य होने के लिए, एक चुनी हुई विधि लागत प्रभावी होनी चाहिए। कई जैविक प्रयोगशालाओं के लिए, पारंपरिक नरम फोटोलिथोग्राफी या प्रत्यक्ष लेजर लेखन से जुड़ा समग्र व्यय एक बाधा प्रस्तुत करता है। हालांकि आवश्यक घटकों को खरीदकर और इकट्ठा करके दोनों तकनीकों को अधिक सुलभ बनाना संभव है, यह दृष्टिकोण अतिरिक्त विशेषज्ञता की मांग करता है और अभी भी एक उल्लेखनीय निवेश की आवश्यकता है। इस संदर्भ में, विचार करने के लिए एक आवश्यक बिंदु प्रत्यक्ष लेजर लेखन के माध्यम से प्राप्त अनुप्रयोगों का व्यापक स्पेक्ट्रम है। पारंपरिक नरम फोटोलिथोग्राफी के विपरीत, मुख्य रूप से मोल्ड माइक्रोमैन्युफैक्चरिंग तक सीमित, 2 पीपी 3 डी प्रिंटिंग उल्लेखनीय बहुमुखी प्रतिभा प्रदर्शित करती है। इसके संभावित अनुप्रयोग माइक्रोफ्लुइडिक्स और माइक्रो-ऑप्टिक्स से लेकर एकीकृत फोटोनिक्स और माइक्रोमैकेनिक्स तक फैले हुए हैं। यह इस तकनीक में निवेश को कई और विविध वैज्ञानिक क्षेत्रों के लिए एक साझा सुविधा के रूप में आकर्षक बनाता है। उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में तैयार 2PP आधारित पद्धति हमारी संस्था के भीतर तंत्रिका विज्ञान और गणित विभागों के बीच एक अंतःविषय सहयोग का परिणाम है। इसके अतिरिक्त, फोटोरेसिस्ट विकास अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र है, और संभावित रूप से 2PP 3D प्रिंटिंग के अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार कर सकता है। बिंदु में एक मामला आईपी-पीडीएमएस राल का हालिया परिचय है। पीडीएमएस38 जैसे गुणों के साथ संरचनाओं में पोलीमराइज़ करके, यह राल जैव-संगत घटकों के प्रत्यक्ष माइक्रोफैब्रिकेशन की क्षमता को अनलॉक करता है जिसमें जटिल सतह होती है या खोखले स्थान होते हैं। ये पेचीदगियां पारंपरिक प्रतिकृति मोल्डिंग प्रक्रियाओं के माध्यम से समान परिणामों को प्राप्त करने के लिए बाधाओं के रूप में खड़ी हैं।
इस पद्धति के प्रदर्शन के रूप में, एक मॉड्यूलर न्यूरोनल नेटवर्क में दो मॉड्यूल के बीच यूनिडायरेक्शनल कनेक्टिविटी के विकास का सुझाव देते हुए सबूत प्रदान किए गए थे। 2PP तकनीक द्वारा निर्मित माइक्रो-स्केल मोल्ड में कई PDMS कास्टिंग से गुजरने के लिए पर्याप्त धीरज था, और इसमें आवश्यक माइक्रो-स्केल परिशुद्धता है। अंत में, इस काम में वर्णित प्रोटोकॉल के आवेदन का दायरा सचित्र मामले से परे फैली हुई है। जैसे-जैसे 2PP प्रिंटिंग तकनीक तक पहुंच तेजी से व्यापक होती जा रही है, इसके कार्यान्वयन के लिए आवश्यक प्रारंभिक निवेश कम हो जाएगा जबकि इसके संभावित अनुप्रयोगों की सीमा का विस्तार होगा।
The authors have nothing to disclose.
एमजी यूरोपीय नवाचार परिषद (IN-FET परियोजना, GA n 862882, आर्बर-आईओ परियोजना, FLAG-ERA और मानव मस्तिष्क परियोजना, आईडी 650003) और SISSA (तंत्रिका विज्ञान क्षेत्र) के माध्यम से यूरोपीय संघ के H2020 फ्रेमवर्क कार्यक्रम से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है। G.N. इतालवी विश्वविद्यालय और अनुसंधान मंत्रालय (MUR) से अनुदान Dipartimenti di Eccellenza 2018-2022 (गणित क्षेत्र) के माध्यम से वित्तीय सहायता स्वीकार करता है। हम M. Gigante, B. Pastore, और M. Grandolfo को 3D प्रिंटिंग, सेल कल्चरिंग और लाइव-इमेजिंग के साथ-साथ Drs. P. Massobrio, P. Heppenstall, L. Ballerini, Di Clemente, और H.C. Schultheiss को चर्चा के लिए धन्यवाद देते हैं। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशन के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।
2-Propanol | Sigma-Aldrich | 650447 | |
BB cure compact polymerizer | PCube Srl | Wavelengths 365-405 nm, Power 120W | |
BioMed Amber Resin 1 L | formlabs | Resin used for mounting the 3D Printed mold to Petri dish | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | |
CAD application software SolidWorks | Dassault Systèmes SolidWorks Corporation, US | Fusion 360 (Autodesk Inc., US), AutoCAD (Autodesk Inc., US), PTC Creo (PTC corp., US), SolidWorks (Dassault Systèmes SolidWorks corp., US) and Tinkercad (Autodesk Inc., US). ————————————– Tutorials: https://www.mycadsite.com/tutorials.html Trainings: https://www.autodesk.com/training |
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CellTracker Green CMFDA | Invitrogen | C7025 | |
D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
D-AP5 | Tocris | #0106 | |
Deoxyribonuclease I | Sigma-Aldrich | D5025 | |
DeScribe | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
di-Sodium hydrogen phosphate | Sigma-Aldrich | 106585 | |
Gentamicin | Thermo Fisher | 15710049 | |
Hanks′ Balanced Salts | Sigma-Aldrich | H2387 | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H7523 | |
Horse Serum | Sigma-Aldrich | H1138 | |
in vitro MEA recording system MEA2000 mini | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
IP-S Photoresist | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Kynurenic acid | Sigma-Aldrich | K3375 | |
L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | M2643 | |
MEA recording application software (Experimenter) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | ||
Minimum Essential Medium | Sigma-Aldrich | 51412C | |
NanoWrite | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
ophthalmic stab Knife 15° | HESTIA Medical | ||
Photonic Professional GT2 (PPGT2) 3D printer | Nanoscribe GmbH & Co. KG | SN617 | |
Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | ||
Poly(ethyleneimine) solution | Sigma-Aldrich | P3143 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Propylene glycol methyl ether acetate (PGMEA) | Sigma-Aldrich | 484431 | |
Repel-silane ES | Sigma-Aldrich | GE17133201 | |
Soda lime ITO-coated substrates for 3D MF DiLL | Nanoscribe GmbH & Co. KG | ||
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
Substrate-integrated planar MEAs (120MEA100/30iR-ITO-gr) | Multichannel Systems GmBH, Reutlingen, Germany | TiN electrodes, SiN isolator, 4 internal reference electrodes,120 recording electrodes, Electrode spacing 100 µm,Electrode diameter 30 µm | |
SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | ||
Trypsin | Sigma-Aldrich | T1005 | |
Trypsin inhibitor | Sigma-Aldrich | T9003 | |
vacuum pump Single phase asynchronous 2 poles | CIMAMOTORI |