精液中过氧化物酶阳性白细胞的检查

Summary

本文提出了一种经济有效的治疗精液中过氧化物酶阳性白细胞的方法。在计算机辅助精液分析（CASA）系统的辅助下，可以在总共60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，有效提高了男科实验室和男科医生的效率。

Abstract

白细胞精子症可导致精子活力降低、精子形态异常增加、精子DNA片段化指数升高、精子顶体功能受损，甚至影响胚胎发育。它是临床实践中常见的男科疾病，也是男性不育的重要原因之一。在确定是否存在男性生殖道炎症时，男科医生通常选择检查精液中的圆形细胞或精浆弹性蛋白酶作为临床诊断依据。然而，圆形细胞的检查很容易受到脱落的生精细胞和生殖道上皮细胞的影响，这无助于减少抗生素的不分青红皂白和不必要的使用。同时，弹性蛋白酶的检测过程相对复杂、耗时、报告结果缓慢，不利于男性生殖道感染（MGTIs）等疾病的早期诊断和治疗。我们创新地将计算机辅助精液分析（CASA）系统辅助的精液中过氧化物酶阳性白细胞的检测作为白细胞精子症的诊断标准，成功解决了这些问题。该检查只需将四种试剂组成的操作液加入标本中，室温下的总反应时间可控制在20-30min以内。通过随后的涂片和显微镜检查，可以在总共60分钟内获得精液中过氧化物酶阳性白细胞的浓度，可用于诊断男性生殖道是否存在炎症。

Introduction

不孕不育已成为一个全球公共卫生问题，影响着大约15%的育龄夫妇。男性因素约占总不孕症病例的50%，近20%至30%可仅归因于男性因素^1,2,3。男性生殖道感染 （MGTI） 是男性不育的重要原因之一，约占病例的 15% ^4,5。

大多数人的精液中有白细胞，占非精子细胞的 13%，中性粒细胞占 12%，巨噬细胞占 0.9%，淋巴细胞占 0.1%^6,7。根据世界卫生组织 （WHO） 人类精液检查和处理实验室手册（第 5 版），白细胞精子症通常定义为精液中存在 >1 × 10⁶ 个细胞/mL^{白细胞 8}。这种情况可能由许多因素引起，例如环境毒素、药物滥用、精索静脉曲张、MGTI 等，所有这些都可能导致精液中白细胞浓度异常升高⁹.白细胞可提高精液中的活性氧 （ROS） 水平，导致脂质过氧化和蛋白质和 DNA 的氧化损伤，从而导致精子活力降低、精子形态异常增加、精子 DNA 片段化指数升高、精子顶体功能受损，甚至对胚胎发育产生负面影响^10,11。

目前，男科医生在识别生殖道炎症时，通常选择检查精液中的圆形细胞或精浆中的弹性蛋白酶。然而，区分脱落的生精细胞和生殖道上皮细胞通常具有挑战性，它们无助于减少抗生素的不分青红皂白和不必要的使用⁶。后一种检查方法相对复杂、耗时长，结果报告速度慢，不利于MGTI等疾病的早期诊断和治疗。美国泌尿外科协会 （AUA） 建议，当精液分析中的圆形细胞浓度大于 1 ×^{10 6} 个细胞/mL¹² 时，应进一步区分白细胞和生殖道脱落细胞。一些男科实验室利用流式细胞术¹³ 或白细胞抗原（例如 CD45）免疫细胞化学¹⁴ 来检查白细胞。虽然这些方法很精确，但它们既昂贵又耗时，使大规模临床实施变得困难，尤其是在发展中国家。

过氧化物酶广泛分布于各种类型的细胞中，在抵抗氧化应激损伤方面起着至关重要的作用。髓过氧化物酶 （MPO） 是过氧化物酶亚家族的成员，通常在免疫细胞中表达。它在中性粒细胞的嗜天青颗粒^15,16 中表达最高，也在淋巴细胞^17,18、单核细胞和巨噬细胞¹⁹ 中表达。精液中白细胞（尤其是中性粒细胞）的浓度可以通过检查过氧化物酶阳性的圆形细胞来获得 ^7,20。为了使精液中白细胞的检查过程经济、方便、高效，我们重新设计了检查方法。在计算机辅助精液分析（CASA）系统的辅助下，可以在60分钟内获得白细胞的浓度。这种新方法降低了患者的检查成本和等待结果的时间，减轻了实验室技术人员的工作量，缩短了医生的诊疗等待时间。

Protocol

本研究已通过中山大学附属第三医院医学伦理委员会评审批准。 1.工作溶液的制备 收集以下制备工作溶液所必需的试剂 – 邻甲苯胺底物溶液、饱和氯化铵 （NH4Cl） 溶液、148 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠盐 （Na2EDTA） 溶液和 6% （v/v） 过氧化氢溶液。将它们与必要的工具一起放在室温 （RT） 实验室工作台上，例如移液器（1000 μL、200 μL、10 μL）?…

Representative Results

在实施上述程序时，离心管中的反应物经常表现出半透明的乳白色外观（图1）。检测到明显的棕色可显示白细胞的潜在脱颗粒，这可能导致液体染色。因此，染色过程可能会失败，因此需要重新染色或收集新的精液样本进行重新测试21。 过氧化物酶阳性白细胞呈棕色，与未染色的普通圆形细胞形成鲜明对比（图2?…

Discussion

邻甲苯胺和过氧化氢具有光敏性，暴露在光线下会分解。为确保测试试剂的有效性，建议将制备的工作液存放在黑暗的地方。

精液样本自然表现出异质性特征。在精液样品的制备过程中，正确判断精液的液化状态，并在每次取样前对精液样品进行彻底均质化，对于提高检测结果的可靠性至关重要。精液样品在15分钟内完全液化。如果它们在60分钟后仍未完全液化，则应考虑机…

Materials

148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia B
6% (v/v) hydrogen peroxide solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia D
Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE	Microptic S.L.	1222996; Model type: SCA-SCOPE-H	Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment
Disposable centrifugal tube (1.5 mL)	Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD	2210009	Centrifugal tube for Staining process
Disposable transfer pipette (3 mL)	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20221101	Polymer-based pipette
Electronic counter	None	None	A multichannel counter
Electronic scales	Shanghai Liangping Instrument Co., LTD	D9008084	MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g
Makler counting chamber	Makler	MQ30004	0.01 sq.mm, 10 μm deep
Optical microscope	Olympus	3G41067201307	CX31, 10×40
Ortho-toluidine substrate solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia C
Pipet tips(1 mL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	02923205	1000 tips/unit, 5 units/case
Pipet tips(10 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	00323961	1000 tips/unit, 20 units/case
Pipet tips(200 µL)	Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd	32822810	1000 tips/unit, 20 units/case
Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution	ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD	20230301	Agentia A
SCA counting chamber	Microptic S.L.	102230608	10 µm, 2 Chambers
The container for semen sample	Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD	20230701	Polymer-based receptacle for semen sample
Thermostatic table	Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD	MQ30004	MQ-300
Transfer pipette (10 µL)	Eppendoff	3121000.015
Transfer pipette (1000 µL)	Eppendoff	3121000.12
Transfer pipette (200 µL)	Eppendoff	3121000.082
Two-dimensional shaker	DragonLab	822000010000	VC5A002205