Article de méthode

L’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme

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DOI :

10.3791/66211

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19 janvier 2024

 ,  ,  , 
1Center for Reproductive Medicine, The Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole économique et efficace pour l’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme. À l’aide d’un système d’analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA), la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase dans le sperme peut être obtenue en 60 minutes au total, ce qui améliore efficacement l’efficacité du laboratoire d’andrologie et des andrologues.

Résumé

La leucocytospermie peut entraîner une diminution de la motilité des spermatozoïdes, une augmentation des anomalies morphologiques des spermatozoïdes, une augmentation de l’indice de fragmentation de l’ADN des spermatozoïdes, une altération de la fonction acrosomique des spermatozoïdes et même une altération du développement embryonnaire. Il s’agit d’une maladie andrologique courante dans la pratique clinique et l’une des causes importantes de l’infertilité masculine. Pour déterminer s’il existe une inflammation de l’appareil reproducteur masculin, les andrologues choisissent souvent d’examiner des cellules rondes ou de l’élastase plasmatique séminale dans le sperme comme base de diagnostic clinique. Cependant, l’examen des cellules rondes est facilement influencé par les cellules spermatogènes desquamées et les cellules épithéliales de l’appareil reproducteur, qui ne contribuent pas à réduire l’utilisation aveugle et inutile d’antibiotiques. Dans le même temps, le processus de détection de l’élastase est relativement compliqué, prend du temps et lent, ce qui n’est pas bénéfique pour le diagnostic précoce et le traitement de maladies telles que les infections de l’appareil génital masculin (MGTI). Nous avons appliqué de manière innovante l’examen des leucocytes peroxydases positifs dans le sperme assisté par un système d’analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA) comme critère de diagnostic de la leucocytospermie, résolvant avec succès ces problèmes. Cet examen ne nécessite que l’ajout du fluide de fonctionnement composé de quatre réactifs dans l’échantillon, et le temps de réaction total à température ambiante peut être contrôlé en 20 à 30 minutes. Avec le frottis et l’examen microscopique qui s’ensuivent, la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase dans le sperme peut être obtenue en 60 minutes au total, ce qui peut être utilisé pour diagnostiquer si l’inflammation de l’appareil reproducteur masculin existait.

Introduction

L’infertilité est devenue un problème de santé publique mondial qui touche environ 15 % des couples en âge de procréer. Les facteurs masculins sont dus à environ 50 % des cas totaux d’hypofertilité, et près de 20 % à 30 % peuvent être attribués uniquement aux facteurs masculins 1,2,3. Les infections de l’appareil génital masculin constituent l’une des causes importantes d’infertilité masculine, représentant environ 15 % des cas 4,5.

La plupart des individus ont des leucocytes dans leur sperme, qui constituent 13 % des cellules non spermatozoïdes, avec des proportions différentielles de 12 % pour les neutrophiles, de 0,9 % pour les macrophages et de 0,1 % pour les lymphocytes6,7. Selon le manuel de laboratoire de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour l’examen et le traitement du sperme humain (5e éd.), la leucocytospermie est généralement définie comme la présence de leucocytes >1 ×10 6 cellules/mL dans le sperme8. Cette condition peut être causée par de nombreux facteurs tels que les toxines environnementales, la toxicomanie, les varicocèles, les MGTI, etc., tous susceptibles d’entraîner une augmentation anormale de la concentration de leucocytes dans le sperme9. Les leucocytes peuvent élever les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans le sperme, provoquant une peroxydation lipidique et des dommages oxydatifs aux protéines et à l’ADN, ce qui entraîne une diminution de la motilité des spermatozoïdes, une augmentation des anomalies morphologiques des spermatozoïdes, un indice de fragmentation élevé de l’ADN des spermatozoïdes, une altération de la fonction acrosomique des spermatozoïdes et même des impacts négatifs sur le développement embryonnaire10,11.

Actuellement, les andrologues choisissent généralement d’examiner les cellules rondes du sperme ou de l’élastase dans le plasma séminal lors de l’identification de l’inflammation des voies génitales. Cependant, il est souvent difficile de distinguer les cellules spermatogènes desquamées et les cellules épithéliales de l’appareil reproducteur, qui ne contribuent pas à réduire l’utilisation aveugle et inutile d’antibiotiques6. Cette dernière méthode d’examen est relativement compliquée et prend beaucoup de temps, avec des résultats lents, ce qui n’est pas bénéfique pour le diagnostic précoce et le traitement de maladies telles que les MGTI. L’American Urological Association (AUA) suggère qu’une différenciation plus poussée entre les leucocytes et les cellules desquamées de l’appareil génital devrait être effectuée lorsque la concentration de cellules rondes dans l’analyse du sperme est supérieure à 1 × 106 cellules/mL12. Certains laboratoires d’andrologie utilisent la cytométrie en flux13 ou l’immunocytochimie de l’antigène leucocytaire (par exemple, CD45)14 pour examiner les leucocytes. Bien que ces méthodes soient précises, elles sont coûteuses et prennent beaucoup de temps, ce qui rend difficile la mise en œuvre clinique à grande échelle, en particulier dans les pays en développement.

La peroxydase est largement distribuée dans divers types de cellules et joue un rôle crucial dans la résistance aux dommages causés par le stress oxydatif. La myéloperoxydase (MPO) est un membre de la sous-famille des peroxydases qui est généralement exprimée dans les cellules immunitaires. Il est le plus fortement exprimé dans les granules azurophiles des neutrophiles15,16 et est également exprimé dans les lymphocytes17,18, les monocytes et les macrophages19. La concentration de leucocytes, en particulier de neutrophiles, dans le sperme peut être obtenue en examinant des cellules rondes qui sont peroxydases positives 7,20. Pour rendre le processus d’examen des leucocytes dans le sperme économique, pratique et efficace, nous avons repensé la méthode d’examen. À l’aide du système d’analyse de sperme assistée par ordinateur (CASA), la concentration de leucocytes peut être obtenue en 60 minutes. Cette nouvelle méthode permet de réduire les coûts d’examen des patients et le temps d’attente pour l’obtention des résultats, d’alléger la charge de travail des techniciens de laboratoire et de raccourcir la période d’attente du médecin pour le diagnostic et le traitement.

Protocole

Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité d’éthique médicale du troisième hôpital affilié de l’Université Sun Yat-sen.

1. Préparation de la solution de travail

  1. Rassemblez les réactifs suivants essentiels à la préparation de la solution de travail : solution de substrat d’ortho-toluidine, solution saturée de chlorure d’ammonium (NH4Cl), solution de sel disodique d’acide éthylènediaminetétraacétique à 148 mmol/L (Na2EDTA) et solution de peroxyde d’hydrogène à 6 % (v/v). Placez-les sur une paillasse de laboratoire à température ambiante (RT) avec les outils nécessaires, tels que des pipettes de transfert (1000 μL, 200 μL, 10 μL) et des portoirs de tubes à essai.
    ATTENTION : Lisez la fiche de données de sécurité (FDS) avant de manipuler les réactifs mentionnés ci-dessus.
  2. Préparez un flacon de réactif brun opaque pour stocker et protéger la solution de travail préparée de l’exposition à la lumière.
  3. Transférez les réactifs dans le flacon de réactif brun opaque selon les proportions spécifiées ci-dessous :
    1. Utilisez la pipette de transfert de 200 μL et ajustez l’échelle à 100 μL en tournant le bouton. Ensuite, transvasez 100 μL de la solution NH4Cl dans le flacon de réactif brun opaque.
    2. Remplacez l’embout de la pipette et transférez 100 μL de la solution d’EDTA Na2à 148 mmol/L dans le flacon de réactif brun opaque à l’aide de la pipette de transfert de 200 μL mentionnée ci-dessus. Ensuite, soufflez doucement par pipetage et homogénéisez soigneusement la solution.
    3. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 900 μL en tournant le bouton. Ensuite, transvasez 900 μL de la solution de substrat d’ortho-toluidine dans le flacon de réactif brun opaque, soufflez doucement par pipetage et homogénéisez soigneusement la solution.
    4. Utilisez la pipette de transfert de 10 μL et ajustez l’échelle à 5 μL en tournant le bouton. Ensuite, transvasez 5 μL de la solution de peroxyde d’hydrogène à 6 % (v/v) dans le flacon de réactif brun opaque.
  4. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 1000 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, soufflez doucement par pipetage et homogénéisez soigneusement la solution dans le flacon de réactif brun opaque.
  5. Conservez la solution de travail prête à l’emploi dans le flacon de réactif brun opaque à RT, à l’abri de la lumière. La solution de travail est réactive pendant 24 h.
  6. Chaque échantillon de sperme nécessite 900 μL de la solution de travail. S’assurer que la quantité de solution de travail préparée chaque jour correspond au nombre d’échantillons examinés quotidiennement.

2. Préparation de l’échantillon de sperme

  1. Avant de prélever l’échantillon de sperme, assurez-vous que le patient s’est abstenu d’éjaculer pendant 2 à 7 jours, comme l’exige le manuel de laboratoire de l’Organisation mondiale de la santé (OMS) pour l’examen et le traitement du sperme humain (5e éd.) 8. La masturbation est la méthode préférée pour obtenir des échantillons de sperme. Pour améliorer la précision de l’examen, demandez au patient de recueillir tout le sperme éjaculé.
  2. Allumez le support à température constante et chauffez jusqu’à 37 °C à l’avance afin que la liquéfaction ultérieure de l’échantillon de sperme puisse se dérouler sans problème.
  3. À la réception de l’échantillon de sperme du patient, notez méticuleusement les informations détaillées, y compris le code d’identification, le temps de prélèvement, la durée d’abstinence et d’autres informations pertinentes, sur la paroi extérieure du récipient à base de polymère.
  4. Placez le récipient à base de polymère contenant l’échantillon de sperme sur le support à température constante préchauffé à 37 °C, ce qui est bénéfique pour la liquéfaction du sperme.
  5. Prélever l’échantillon de sperme dans une pipette à base de polymère et observer l’état de liquéfaction toutes les 5 minutes jusqu’à ce que l’échantillon de sperme soit complètement liquéfié.
  6. Si l’échantillon de sperme n’a pas été complètement liquéfié dans les 30 minutes, n’effectuez pas encore l’examen ; Continuez à attendre encore 30 minutes. Si le sperme n’est toujours pas complètement liquéfié après 60 min, ajoutez un volume égal de solution tampon de phosphate pour une dilution de 1 :1 et agitez doucement pour favoriser la liquéfaction.
  7. Après une agitation complète et une homogénéisation constante, conservez l’échantillon de sperme entièrement liquéfié pour les procédures d’examen ultérieures.

3. Coloration des leucocytes positifs à la peroxydase et analyse de l’échantillon de sperme d’origine

  1. Avant l’échantillonnage, utilisez une pipette à base de polymère pour souffler à plusieurs reprises par pipetage et homogénéiser soigneusement l’échantillon de sperme examiné.
  2. Utilisez la pipette de transfert de 200 μL et ajustez l’échelle à 100 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, puis transférez 100 μL de l’échantillon de sperme dans un tube à centrifuger.
  3. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 900 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, puis transférez 900 μL de la solution de travail mentionnée ci-dessus dans le tube à centrifuger.
  4. Souffler à plusieurs reprises par pipetage et homogénéiser soigneusement le réactif, qui se compose de l’échantillon de sperme et de la solution de travail, à l’aide de la pipette de transfert de 1000 μL.
  5. Positionnez le tube à centrifuger dans un rack de tubes à essai sur un agitateur bidimensionnel et soumettez-le à une agitation continue à 200 tr/min pendant 30 min à RT.
  6. En attendant la réaction de coloration, analysez l’échantillon de sperme à l’aide du système CASA pour déterminer la concentration de spermatozoïdes dans l’échantillon de sperme d’origine dans le récipient à base de polymère.
    1. Allumez l’interrupteur d’alimentation du système CASA et double-cliquez sur l’icône SCA SCOPE pour ouvrir le logiciel d’application.
    2. Avant le prélèvement, souffler à plusieurs reprises par pipetage et homogénéiser à nouveau soigneusement l’échantillon de sperme d’origine avec une pipette à base de polymère.
    3. Utilisez la pipette de transfert de 10 μL et ajustez l’échelle à 10 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, pipetez jusqu’à 10 μL de l’échantillon de sperme d’origine et placez-le dans la chambre de comptage SCA. Attendez 60 s pour que l’échantillon de sperme cesse de dériver.
    4. Positionnez la chambre de comptage SCA sur le porte-échantillon du système CASA et définissez les informations du patient dans la boîte de dialogue du logiciel d’application pour préparer l’examen formel.
    5. Examinez l’échantillon de sperme d’origine dans la chambre de comptage SCA avec le système CASA en cliquant sur le bouton Démarrer et enregistrez les données nécessaires, telles que la concentration de spermatozoïdes.

4. Observation des leucocytes et des spermatozoïdes peroxydases positifs

  1. Utilisez la pipette de transfert de 1000 μL et ajustez l’échelle à 1000 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, puis soufflez à plusieurs reprises par pipetage et homogénéisez soigneusement le réactif, qui se compose d’un échantillon de sperme et d’une solution de travail dans le tube à centrifuger à la fin du processus de réaction de 30 minutes.
  2. Utilisez la pipette de transfert de 10 μL et ajustez l’échelle à 10 μL en tournant le bouton. Replacez l’embout de la pipette, pipetez jusqu’à 10 μL du réactif mentionné ci-dessus et placez-le dans la chambre de comptage des spermatozoïdes. Enfin, couvrez la chambre de comptage des spermatozoïdes avec une lamelle en verre dédiée.
  3. Placez la chambre de comptage des spermatozoïdes sur la platine microscopique et allumez l’interrupteur d’alimentation du microscope optique avec deux oculaires 10x. Ensuite, attendez 60 s pour que l’échantillon de réactif cesse de dériver.
  4. Basculez le convertisseur microscopique sur l’objectif 10x pendant le temps d’attente. Ajustez ensuite le bouton de réglage grossier et le bouton de réglage fin dans l’ordre. Enfin, observez les spermatozoïdes et les cellules rondes sous un grossissement de 10×10.
  5. Basculez le convertisseur microscopique sur la lentille de l’objectif 40x après avoir déterminé le champ de vision à analyser, et observez les spermatozoïdes et les leucocytes bruns positifs à la peroxydase sous un grossissement de 10 × 40.
  6. Utilisez le système de comptage électronique pour compter au moins 200 spermatozoïdes et le nombre de leucocytes bruns positifs à la peroxydase dans les champs correspondants.

5. Calcul de la concentration de leucocytes peroxydases positifs

  1. Calculez la concentration de leucocytes peroxydases positifs à l’aide de la formule suivante :
    formule d’équilibre statique ; équation de concentration en leucocytes ; Schéma pédagogique

Résultats

Lors de la mise en œuvre de la procédure susmentionnée, le réactif dans le tube à centrifuger présente fréquemment un aspect subtranslucide et opalescent (Figure 1). La détection d’une couleur manifestement brune révèle une dégranulation potentielle des leucocytes, ce qui peut entraîner une coloration liquide. Par conséquent, le processus de coloration pourrait échouer, ce qui rendrait nécessaire soit une nouvelle coloration, soit le prélèvement d’un nouvel échantillon de sperme pour un nouveau test21.

Les leucocytes positifs à la peroxydase présentaient une teinte brune, contrastant avec les cellules rondes ordinaires non colorées (Figure 2, lame ordinaire). Par la suite, tous les spermatozoïdes et leucocytes bruns sous le champ de microscope actuel ont été comptés avant de passer à un champ entièrement nouveau pour l’observation et le comptage continus. Pour assurer une précision optimale, il est nécessaire de compter un minimum de 200 spermatozoïdes et les leucocytes présents dans le champ de vision correspondant.

Tube de microcentrifugation dans une expérience d’extraction d’ADN, montrant le processus de séparation des liquides.
Figure 1 : Solution de réactif. Le réactif qui complète le processus de réaction est un liquide opalescent subtranslucide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Coloration à l’ortho-toluidine, dosage de la peroxydase, spermatozoïdes, image au microscope, biologie cellulaire.
Figure 2 : Observation au microscope optique (lame ordinaire). (A) leucocyte à peroxydase positive et (B) cellule ronde ordinaire observée au microscope optique à grossissement 10 x 40. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’ortho-toluidine et le peroxyde d’hydrogène ont des propriétés photosensibles et peuvent se décomposer lorsqu’ils sont exposés à la lumière. Pour garantir l’efficacité des réactifs de test, il est recommandé de stocker le fluide de travail préparé dans un endroit sombre.

Les échantillons de sperme présentent naturellement des caractéristiques hétérogènes. Dans le processus de préparation des échantillons de sperme, il est crucial d’évaluer correctement l’état de liquéfaction du sperme et d’homogénéiser soigneusement les échantillons de sperme avant chaque prélèvement pour améliorer la fiabilité des résultats des tests. Les échantillons de sperme se liquéfient complètement en 15 minutes. Une homogénéisation mécanique ou une digestion enzymatique doivent être envisagées s’ils ne sont pas complètement liquéfiés après 60 min. Des échantillons de sperme plus homogènes peuvent être obtenus en agitant doucement le récipient d’échantillon en continu pendant le processus de liquéfaction à l’aide d’un agitateur bidimensionnel8.

La méthode d’examen présentée dans cet article présente les avantages de la simplicité, de la rapidité et de la rentabilité. Cependant, elle peut ne pas être avantageuse dans certaines circonstances : la peroxydase est stockée dans des granules azurophiles qui seront sécrétés dans l’espace intercellulaire par dégranulation ou cytopempse lors de l’activation21,22. Par conséquent, les neutrophiles peuvent ne pas se colorer et ne peuvent pas être identifiés. Dans de tels cas, il devient nécessaire de répéter le processus de coloration ou même d’exiger du patient qu’il fournisse un nouvel échantillon de sperme pour un nouvel examen. Pour minimiser cette situation, il est recommandé d’utiliser des échantillons de sperme frais dans la mesure du possible avec un temps de placement minimal et un processus d’homogénéisation doux. Cette méthode ne permet d’identifier que les maladies ou infections actives et ne peut pas identifier les maladies à des stades ultérieurs, telles que les infections chroniques16. De plus, d’autres types de leucocytes à faible teneur en peroxydase, tels que les lymphocytes, les macrophages et les monocytes, posent des difficultés de coloration à l’aide de cette méthode ; par conséquent, l’obtention de résultats fiables peut être obtenue en utilisant la coloration immunohistochimique de l’antigène leucocytaire (par exemple, CD45).

Comme l’exige la 5e édition du manuel de l’OMS, la coloration traditionnelle positive de la myéloperoxydase (test d’Endtz) nécessite un comptage microscopique d’au moins 200 leucocytes positifs à la peroxydase dans une plaque de numération des cellules sanguines pour calculer leur concentration8. Par rapport au test manuel traditionnel d’Endtz, ce protocole introduit les données de concentration en spermatozoïdes obtenues par détection CASA, en combinant des méthodes manuelles et automatiques. Pour calculer la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase, au moins 200 spermatozoïdes et leucocytes dans le champ de vision correspondant ont été comptés au microscope. Étant donné que la concentration de spermatozoïdes dans le sperme est beaucoup plus élevée que celle des leucocytes, il a fallu moins de temps pour compter 200 spermatozoïdes que pour compter 200 leucocytes positifs à la peroxydase.

Les patients atteints d’oligospermie sévère, de cryptozoospermie et d’azoospermie ont souvent du mal à compter un nombre suffisant de spermatozoïdes. Dans de tels cas, la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase peut être calculée directement à l’aide d’une plaque de comptage des cellules sanguines comme décrit dans le manuel de la plaque. De plus, pour les patients qui n’ont pas besoin de CASA ou de laboratoires sans équipement CASA, une plaque de comptage des cellules sanguines peut également être utilisée pour déterminer la concentration de leucocytes positifs à la peroxydase.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le laboratoire d’andrologie du Centre de médecine de la reproduction, le troisième hôpital affilié de l’Université Sun Yat-sen, d’avoir fourni les installations nécessaires à cette étude. Aucun financement n’a été impliqué dans la préparation de cet article.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
148 mmol/L d’acide éthylènediamine tétraacétique disodique (Na2EDTA)ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD20230301Agentia B
6 % (v/v) solution de peroxyde d’hydrogèneShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD20230301Agentia D Analyseur
automatique de classe de sperme &ndash ; CHAMP D’APPLICATION DE LA SCA&NBSP ;Microptic S.L.1222996 ; Type de modèle : SCA-SCOPE-HÉquipement d’analyse de sperme assistée par ordinateur (CASA)
Tube centrifuge jetable (1,5 mL)Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD2210009Tube centrifuge pour processus de coloration
Pipette de transfert jetable (3 mL)Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD20221101Pipette à base de polymère
Compteur électroniqueAucunAucunA compteur multicanaux
Balances électroniquesShanghai Liangping Instrument Co., LTDD9008084MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0,01 g
Chambre de comptageMakler MaklerMQ300040,01 sq.mm, 10 &mu ; m deep
Microscope optiqueOlympus3G41067201307CX31, 10&fois ; 40
Solution de substrat d’ortho-toluidineShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD20230301Agentia C Pointes
de pipette (1 mL)Coming Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd029232051000 pointes/unité, 5 unités/caisse
Pointes de pipette (10 µ ; L)Coming Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd003239611000 pointes / unité, 20 unités / caisse
Pointes de pipette (200 & micro ; L)Coming Life Sciences (Wujiang) Co., Ltd328228101000 pointes/unité, 20 unités/caisse
Chlorure d’ammonium saturé (NH4Cl) solutionShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co., LTD20230301Agentia A
SCA chambre de comptageMicroptic S.L.10223060810 et micro ; m, 2 Chambres
Le récipient pour échantillon de spermeJiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD20230701Réceptacle à base de polymère pour échantillon de sperme
Table thermostatiqueShenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTDMQ30004MQ-300
Pipette de transfert (10 µ ; L)Eppendoff3121000.015
Pipette de transfert (1000 µ ; L)Eppendoff3121000.12
Pipette de transfert (200 µ ; L)Eppendoff3121000.082
Agitateur bidimensionnelDragonLab822000010000VC5A002205
Solution de peroxyde d’hydrogène

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Réimpressions et autorisations

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