L'esame dei leucociti positivi alla perossidasi nel liquido seminale
Summary
Questo documento presenta un protocollo economico ed efficiente per l’esame dei leucociti positivi alla perossidasi nello sperma. Con l’assistenza di un sistema di analisi dello sperma computerizzato (CASA), la concentrazione di leucociti positivi alla perossidasi nello sperma può essere ottenuta entro un totale di 60 minuti, migliorando efficacemente l’efficienza del laboratorio di andrologia e degli andrologi.
Abstract
La leucocitospermia può portare a una diminuzione della motilità degli spermatozoi, a un aumento delle anomalie morfologiche degli spermatozoi, a un aumento dell’indice di frammentazione del DNA degli spermatozoi, a una compromissione della funzione dell’acrosoma degli spermatozoi e persino a un aumento dello sviluppo embrionale. È una malattia andrologica comune nella pratica clinica e una delle principali cause di infertilità maschile. Nel determinare se esiste un’infiammazione del tratto riproduttivo maschile, gli andrologi spesso scelgono di esaminare le cellule rotonde o l’elastasi plasmatica seminale nello sperma come base diagnostica clinica. Tuttavia, l’esame delle cellule rotonde è facilmente influenzato dalle cellule spermatogene e dalle cellule epiteliali del tratto riproduttivo, che non contribuiscono a ridurre l’uso indiscriminato e non necessario di antibiotici. Allo stesso tempo, il processo di rilevamento dell’elastasi è relativamente complicato, richiede tempo e è lento nel riportare i risultati, il che non è vantaggioso per la diagnosi precoce e il trattamento di malattie come le infezioni del tratto genitale maschile (MGTI). Abbiamo applicato in modo innovativo l’esame dei leucociti perossidasi-positivi nel liquido seminale assistito da un sistema di analisi del seme computer-assistito (CASA) come criterio diagnostico per la leucocitospermia, risolvendo con successo questi problemi. Questo esame richiede solo l’aggiunta del fluido operativo costituito da quattro reagenti nel campione e il tempo di reazione totale a temperatura ambiente può essere controllato entro 20-30 minuti. Con il successivo striscio e l’esame microscopico, è possibile ottenere la concentrazione di leucociti positivi alla perossidasi nel liquido seminale entro un totale di 60 minuti, che può essere utilizzata per diagnosticare se l’infiammazione del tratto riproduttivo maschile esisteva.
Introduction
L’infertilità è emersa come un problema di salute pubblica globale che colpisce circa il 15% delle coppie in età riproduttiva. I fattori maschili sono rappresentati da circa il 50% dei casi totali di subfertilità e quasi il 20-30% può essere attribuito esclusivamente ai fattori maschili 1,2,3. Le infezioni del tratto genitale maschile (MGTI) costituiscono una delle principali cause di infertilità maschile, rappresentando circa il 15% dei casi 4,5.
La maggior parte degli individui ha leucociti nel proprio sperma, costituendo il 13% delle cellule non spermatozoiche, con proporzioni differenziali che sono neutrofili 12%, macrofagi 0,9% e linfociti 0,1%6,7. Secondo il manuale di laboratorio dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) per l’esame e il trattamento dello sperma umano (5a ed.), la leucocitospermia è solitamente definita come la presenza di leucociti >1 ×10 6 cellule/mL nel seme8. Questa condizione può essere causata da numerosi fattori come tossine ambientali, abuso di sostanze, varicocele, MGTI, ecc., che potenzialmente portano a un aumento anomalo della concentrazione di leucociti nello sperma9. I leucociti possono aumentare i livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS) nello sperma, causando perossidazione lipidica e danni ossidativi alle proteine e al DNA, che si traducono in una diminuzione della motilità degli spermatozoi, un aumento delle anomalie morfologiche degli spermatozoi, un elevato indice di frammentazione del DNA degli spermatozoi, una compromissione della funzione acrosomica degli spermatozoi e persino impatti negativi sullo sviluppo embrionale10,11.
Attualmente, gli andrologi scelgono comunemente di esaminare le cellule rotonde nello sperma o l’elastasi nel plasma seminale quando identificano l’infiammazione del tratto genitale. Tuttavia, è spesso difficile distinguere le cellule spermatogene e le cellule epiteliali del tratto riproduttivo, che non contribuiscono a ridurre l’uso indiscriminato e non necessario di antibiotici6. Quest’ultimo metodo di esame è relativamente complicato e richiede molto tempo, con una lenta refertazione dei risultati, il che non è vantaggioso per la diagnosi precoce e il trattamento di malattie come le MGTI. L’American Urological Association (AUA) suggerisce un’ulteriore differenziazione tra leucociti e cellule sloughed dal tratto genitale quando la concentrazione di cellule rotonde nell’analisi dello sperma è superiore a 1 ×10 6 cellule/mL12. Alcuni laboratori di andrologia utilizzano la citometria a flusso13 o l’immunocitochimica dell’antigene leucocitario (ad es. CD45)14 per esaminare i leucociti. Sebbene questi metodi siano precisi, sono costosi e richiedono molto tempo, rendendo difficile l’implementazione clinica su larga scala, soprattutto nei paesi in via di sviluppo.
La perossidasi è ampiamente distribuita in vari tipi di cellule e svolge un ruolo cruciale nella resistenza ai danni da stress ossidativo. La mieloperossidasi (MPO) è un membro della sottofamiglia delle perossidasi che è generalmente espressa nelle cellule immunitarie. È più altamente espresso nei granuli azurofili dei neutrofili15,16 ed è anche espresso nei linfociti17,18, nei monociti e nei macrofagi19. La concentrazione di leucociti, in particolare neutrofili, nel liquido seminale può essere ottenuta esaminando le cellule rotonde positive alla perossidasi 7,20. Per rendere il processo di esame dei leucociti nello sperma economico, conveniente ed efficiente, abbiamo riprogettato il metodo di esame. Con l’aiuto del sistema di analisi computerizzata dello sperma (CASA), la concentrazione di leucociti può essere ottenuta entro 60 minuti. Questo nuovo metodo riduce i costi degli esami dei pazienti e i tempi di attesa per ottenere i risultati, allevia il carico di lavoro dei tecnici di laboratorio e abbrevia il periodo di attesa per la diagnosi e il trattamento del medico.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’orto-toluidina e il perossido di idrogeno hanno proprietà fotosensibili e possono decomporsi se esposti alla luce. Per garantire l’efficacia dei reagenti in esame, si consiglia di conservare il fluido di lavoro preparato in un luogo buio.
I campioni di sperma presentano naturalmente caratteristiche eterogenee. Nel processo di preparazione dei campioni di sperma, giudicare correttamente lo stato di liquefazione dello sperma e omogeneizzare accuratamente i campioni di sperma prima di ogni ca…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori sono grati al Laboratorio di Andrologia del Centro di Medicina Riproduttiva, il Terzo Ospedale Affiliato dell’Università Sun Yat-sen, per aver fornito le strutture per questo studio. Nessun finanziamento è stato coinvolto nella preparazione di questo articolo.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
