Undersøkelsen av peroksidase-positive leukocytter i sæd
Summary
Dette papiret presenterer en økonomisk og effektiv protokoll for å undersøke peroksidase-positive leukocytter i sæd. Ved hjelp av et dataassistert sædanalysesystem (CASA) kan konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter i sæd oppnås innen totalt 60 minutter, noe som effektivt forbedrer effektiviteten til andrologisk laboratorium og androloger.
Abstract
Leukocytospermi kan føre til redusert spermatozoa motilitet, økte spermatozoa morfologiske abnormiteter, forhøyet spermatozoa DNA-fragmenteringsindeks, svekkelse av spermatozoa akrosomfunksjonen, og til og med påvirket embryonal utvikling. Det er en vanlig andrologisk sykdom i klinisk praksis og en av de viktigste årsakene til mannlig infertilitet. Ved å avgjøre om mannlig reproduksjonstarmbetennelse eksisterer, velger androloger ofte å undersøke runde celler eller seminal plasmaelastase i sæden som et klinisk diagnostisk grunnlag. Imidlertid er undersøkelsen av runde celler lett påvirket av sloughed spermatogene celler og epitelceller i reproduktive kanaler, som ikke bidrar til å redusere ukritisk og unødvendig bruk av antibiotika. Samtidig er deteksjonsprosessen av elastase relativt komplisert, tidkrevende og langsom i rapportering av resultater, noe som ikke er gunstig for tidlig diagnose og behandling av sykdommer som mannlige kjønnsorganinfeksjoner (MGTI). Vi har innovativt anvendt undersøkelsen av peroksidase-positive leukocytter i sæd assistert av et dataassistert sædanalysesystem (CASA) som et diagnostisk kriterium for leukocytospermi, og vellykket løsning av disse problemene. Denne undersøkelsen krever bare tilsetning av driftsvæsken bestående av fire reagenser i prøven, og den totale reaksjonstiden ved romtemperatur kan styres innen 20-30 minutter. Ved den etterfølgende smøring og mikroskopisk undersøkelse kan konsentrasjonen av peroksidase-positive leukocytter i sæd oppnås innen totalt 60 minutter, som kan brukes til å diagnostisere om betennelsen i den mannlige reproduktive kanalen eksisterte.
Introduction
Infertilitet har dukket opp som et globalt folkehelseproblem som påvirker omtrent 15% av parene i deres reproduktive alder. Mannlige faktorer bidrar med rundt 50% av de totale subfertilitetstilfellene, og nesten 20% til 30% kan tilskrives utelukkende mannlige faktorer 1,2,3. Mannlige kjønnsorganinfeksjoner (MGTI) utgjør en av de viktigste årsakene til mannlig infertilitet, og står for ca 15% av tilfellene 4,5.
De fleste individer har leukocytter i sæden, som utgjør 13% av ikke-spermatozoanceller, med differensielle proporsjoner som nøytrofiler 12%, makrofager 0,9% og lymfocytter 0,1%6,7. Ifølge Verdens helseorganisasjons (WHO) laboratoriehåndbok for undersøkelse og behandling av human sæd (5. utg.), er leukocytospermi vanligvis definert som tilstedeværelse av >1 × 106 celler / ml leukocytter i sæd8. Denne tilstanden kan skyldes mange faktorer som miljøgifter, stoffmisbruk, varicoceles, MGTI, etc., som alle potensielt fører til en unormal økning i leukocyttkonsentrasjonen i sæd9. Leukocytter kan heve nivået av reaktive oksygenarter (ROS) i sæd, forårsaker lipidperoksydasjon og oksidativ skade på protein og DNA, noe som resulterer i redusert spermatozoa-motilitet, økte morfologiske abnormiteter i spermatozoa, forhøyede spermatozoer DNA-fragmenteringsindeks, svekkelse av spermatozoa-akrosomfunksjonen, og til og med negative virkninger på embryoutvikling10,11.
For tiden velger androloger ofte å undersøke runde celler i sæd eller elastase i sædplasma når de identifiserer betennelse i kjønnsorganene. Imidlertid er det ofte utfordrende å skille sloughed spermatogene celler og epitelceller i reproduktive kanaler, som ikke bidrar til å redusere ukritisk og unødvendig bruk av antibiotika6. Sistnevnte undersøkelsesmetode er relativt komplisert og tidkrevende, med langsom resultatrapportering, noe som ikke er gunstig for tidlig diagnose og behandling av sykdommer som MGTI. American Urological Association (AUA) foreslår ytterligere differensiering mellom leukocytter og sloughed celler fra kjønnsorganet bør gjøres når den runde cellekonsentrasjonen i sædanalyse er større enn 1 × 106 celler / ml12. Noen andrologilaboratorier bruker flowcytometri13 eller leukocyttantigen (f.eks. CD45) immunocytokjemi14 for å undersøke leukocytter. Selv om disse metodene er presise, er de dyre og tidkrevende, noe som gjør klinisk implementering i stor skala vanskelig, spesielt i utviklingsland.
Peroksidase er utbredt i ulike typer celler og spiller en avgjørende rolle i motstanden mot oksidativ stressskade. Myeloperoksidase (MPO) er medlem av peroksidase-underfamilien som vanligvis uttrykkes i immunceller. Det uttrykkes mest i nøytrofilenes azurofile granulater15,16 og uttrykkes også i lymfocytter17,18, monocytter og makrofager19. Konsentrasjonen av leukocytter, spesielt nøytrofiler, i sæd kan oppnås ved å undersøke runde celler som er peroksidase-positive 7,20. For å gjøre undersøkelsesprosessen av leukocytter i sæd økonomisk, praktisk og effektiv, reengineered vi undersøkelsesmetoden. Assistert av CASA-systemet (Computer-Assisted Semen Analysis), kan konsentrasjonen av leukocytter oppnås innen 60 minutter. Denne nye metoden reduserer pasientenes undersøkelseskostnader og ventetid for å oppnå resultater, letter arbeidsbelastningen til laboratorieteknikere og forkorter legens diagnose og behandlingstid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orto-toluidin og hydrogenperoksid har lysfølsomme egenskaper og kan brytes ned når de utsettes for lys. For å sikre effektiviteten av testreagensene, anbefales det at det forberedte arbeidsfluidet lagres på et mørkt sted.
Sædprøver viser naturlig heterogene egenskaper. I fremstillingsprosessen av sædprøver er korrekt bedømmelse av flytendegjøringstilstanden til sæd og grundig homogenisering av sædprøvene før hver prøvetaking avgjørende for å forbedre påliteligheten av testr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne er takknemlige for Andrology Laboratory ved Center for Reproductive Medicine, det tredje tilknyttede sykehuset i Sun Yat-sen University, for å gi fasilitetene til denne studien. Ingen finansiering var involvert i utarbeidelsen av denne artikkelen.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
