O Exame de Leucócitos Peroxidase Positivos no Sêmen
Summary
Este trabalho apresenta um protocolo econômico e eficiente para o exame de leucócitos peroxidase positiva no sêmen. Com o auxílio de um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida em um total de 60 min, melhorando efetivamente a eficiência do laboratório de andrologia e dos andrologistas.
Abstract
A leucocitospermia pode levar à diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides elevados, comprometimento da função acrossômica dos espermatozoides e até mesmo desenvolvimento embrionário afetado. É uma doença andrológica comum na prática clínica e uma das importantes causas de infertilidade masculina. Ao determinar se a inflamação do trato reprodutivo masculino existe, os andrologistas geralmente optam por examinar as células redondas ou a elastase plasmática seminal no sêmen como base de diagnóstico clínico. No entanto, o exame de células redondas é facilmente influenciado por células espermatogênicas descamadas e células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos. Ao mesmo tempo, o processo de detecção da elastase é relativamente complicado, demorado e lento na comunicação de resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como infecções do trato genital masculino (ITMG). Aplicamos de forma inovadora o exame de leucócitos peroxidase positiva em sêmen assistido por um sistema de análise seminal assistida por computador (CASA) como critério diagnóstico para leucocitospermia, resolvendo com sucesso esses problemas. Este exame requer apenas a adição do fluido operacional composto por quatro reagentes na amostra, e o tempo total de reação à temperatura ambiente pode ser controlado dentro de 20-30 min. Com o esfregaço subsequente e o exame microscópico, a concentração de leucócitos positivos para peroxidase no sêmen pode ser obtida dentro de um total de 60 min, que pode ser usado para diagnosticar se a inflamação do trato reprodutor masculino existiu.
Introduction
A infertilidade emergiu como um problema de saúde pública global que afeta aproximadamente 15% dos casais em idade reprodutiva. Os fatores masculinos são responsáveis por cerca de 50% do total de casos de subfertilidade, e cerca de 20% a 30% podem ser atribuídos exclusivamente aos fatores masculinos 1,2,3. As infecções do trato genital masculino (ITMG) constituem uma das causas significativas de infertilidade masculina, sendo responsáveis por cerca de 15% dos casos 4,5.
A maioria dos indivíduos possui leucócitos no sêmen, constituindo 13% das células não espermáticas, sendo as proporções diferenciais neutrófilos 12%, macrófagos 0,9% e linfócitos 0,1%6,7. De acordo com o manual laboratorial da Organização Mundial da Saúde (OMS) para exame e processamento de sêmen humano (5ª ed.), a leucocitospermia é usualmente definida como a presença de leucócitos >1 ×10 6 células/mL no sêmen8. Essa condição pode ser causada por inúmeros fatores, como toxinas ambientais, abuso de substâncias, varicoceles, MGTIs, etc., todos potencialmente levando a um aumento anormal da concentração leucocitária no sêmen9. Os leucócitos podem elevar os níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs) no sêmen, causando peroxidação lipídica e danos oxidativos à proteína e ao DNA, o que resulta em diminuição da motilidade dos espermatozoides, aumento das anormalidades morfológicas dos espermatozoides, aumento do índice de fragmentação do DNA dos espermatozoides, comprometimento da função acrossomal dos espermatozoides e até mesmo impactos negativos no desenvolvimento embrionário10,11.
Atualmente, os andrologistas geralmente optam por examinar células redondas no sêmen ou elastase no plasma seminal ao identificar a inflamação do trato genital. No entanto, muitas vezes é desafiador distinguir as células espermatogênicas esfaceladas das células epiteliais do trato reprodutivo, que não contribuem para reduzir o uso indiscriminado e desnecessário de antibióticos6. Este último método de exame é relativamente complicado e demorado, com notificação lenta dos resultados, o que não é benéfico para o diagnóstico precoce e tratamento de doenças como os ITMG. A American Urological Association (AUA) sugere que uma maior diferenciação entre leucócitos e células esfaceladas do trato genital deve ser feita quando a concentração de células redondas na análise do sêmen for maior que 1 × 106 células/mL12. Alguns laboratórios de andrologia utilizam citometria de fluxo13 ou imunocitoquímica de antígenos leucocitários (por exemplo, CD45)14 para examinar leucócitos. Embora esses métodos sejam precisos, são caros e demorados, dificultando a implementação clínica em larga escala, especialmente em países em desenvolvimento.
A peroxidase é amplamente distribuída em vários tipos de células e desempenha um papel crucial na resistência ao dano do estresse oxidativo. A mieloperoxidase (MPO) é um membro da subfamília das peroxidases que é geralmente expressa em células imunes. É mais altamente expressa nos grânulos azurofílicos dos neutrófilos15,16 e também é expressa em linfócitos17,18, monócitos e macrófagos19. A concentração de leucócitos, especialmente neutrófilos, no sêmen pode ser obtida pelo exame de células redondas positivas para peroxidase 7,20. Para tornar o processo de exame de leucócitos no sêmen econômico, conveniente e eficiente, reformulamos o método de exame. Assistida pelo sistema de análise seminal assistida por computador (CASA), a concentração de leucócitos pode ser obtida em 60 min. Esse novo método reduz os custos dos exames dos pacientes e o tempo de espera para a obtenção dos resultados, alivia a carga de trabalho dos técnicos de laboratório e encurta o período de espera para diagnóstico e tratamento do médico.
Protocol
Representative Results
Discussion
A orto-toluidina e o peróxido de hidrogênio têm propriedades fotossensíveis e podem se decompor quando expostos à luz. Para garantir a eficácia dos reagentes de teste, recomenda-se que o fluido de trabalho preparado seja armazenado em um local escuro.
As amostras de sêmen naturalmente exibem características heterogêneas. No processo de preparação de amostras de sêmen, julgar corretamente o estado de liquefação do sêmen e homogeneizar completamente as amostras de sêmen antes de…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos ao Laboratório de Andrologia do Centro de Medicina Reprodutiva, o Terceiro Hospital Afiliado da Universidade Sun Yat-sen, por fornecer as instalações para este estudo. Nenhum financiamento foi envolvido na elaboração deste artigo.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
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