Undersökning av peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätska
Summary
Denna artikel presenterar ett ekonomiskt och effektivt protokoll för att undersöka peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätska. Med hjälp av ett datorstödt spermaanalyssystem (CASA) kan koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter i sperma erhållas inom totalt 60 minuter, vilket effektivt förbättrar effektiviteten hos andrologilaboratorier och androloger.
Abstract
Leukocytospermi kan leda till minskad spermierörlighet, ökad spermatozomorfologiska avvikelser, förhöjt DNA-fragmenteringsindex för spermier, försämring av spermiernas akrosomfunktion och till och med påverkad embryonal utveckling. Det är en vanlig andrologisk sjukdom i klinisk praxis och en av de viktigaste orsakerna till manlig infertilitet. När man avgör om det finns inflammation i de manliga könsorganen väljer androloger ofta att undersöka runda celler eller sädesplasmaelastas i sädesvätskan som en klinisk diagnostisk grund. Undersökningen av rundceller påverkas dock lätt av borttappade spermatogena celler och epitelceller från reproduktionsorganen, som inte bidrar till att minska den urskillningslösa och onödiga användningen av antibiotika. Samtidigt är detektionsprocessen av elastas relativt komplicerad, tidskrävande och långsam när det gäller att rapportera resultat, vilket inte är fördelaktigt för tidig diagnos och behandling av sjukdomar som manliga genitala infektioner (MGTI). Vi har på ett innovativt sätt tillämpat undersökning av peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätska med hjälp av ett datorstödt spermaanalyssystem (CASA) som ett diagnostiskt kriterium för leukocytospermi, och framgångsrikt löst dessa problem. Denna undersökning kräver endast tillsats av driftsvätskan bestående av fyra reagenser i provet, och den totala reaktionstiden vid rumstemperatur kan kontrolleras inom 20-30 minuter. Med efterföljande utstryk och mikroskopisk undersökning kan koncentrationen av peroxidaspositiva leukocyter i sädesvätskan erhållas inom totalt 60 minuter, vilket kan användas för att diagnostisera om inflammation i det manliga könsorganet existerade.
Introduction
Infertilitet har blivit ett globalt folkhälsoproblem som drabbar cirka 15 % av alla par i fertil ålder. Manliga faktorer bidrar med cirka 50 % av de totala subfertilitetsfallen, och nästan 20 % till 30 % kan enbart hänföras till manliga faktorer 1,2,3. Manliga genitala infektioner (MGTI) utgör en av de viktigaste orsakerna till manlig infertilitet och står för cirka 15 % av fallen 4,5.
De flesta individer har leukocyter i sädesvätskan, som utgör 13 % av icke-spermieceller, med differentiella andelar som neutrofiler 12 %, makrofager 0,9 % och lymfocyter 0,1 %6,7. Enligt Världshälsoorganisationens (WHO) laboratoriemanual för undersökning och bearbetning av mänsklig sperma (5:e upplagan) definieras leukocytospermi vanligtvis som närvaron av >1 × 106 celler/ml leukocyter i sperma8. Detta tillstånd kan orsakas av många faktorer som miljögifter, missbruk, varicoceles, MGTI, etc., som alla kan leda till en onormal ökning av leukocytkoncentrationen i sperma9. Leukocyter kan höja nivåerna av reaktiva syreradikaler (ROS) i sädesvätskan, vilket orsakar lipidperoxidation och oxidativ skada på protein och DNA, vilket resulterar i minskad spermiemotilitet, ökade morfologiska avvikelser hos spermier, förhöjt DNA-fragmenteringsindex för spermier, försämring av spermiernas akrosomfunktion och till och med negativa effekter på embryoutvecklingen10,11.
För närvarande väljer androloger ofta att undersöka runda celler i sperma eller elastas i sädesplasma när de identifierar inflammation i könsorganen. Det är dock ofta svårt att skilja på borttappade spermatogena celler och epitelceller från reproduktionsorganen, som inte bidrar till att minska den urskillningslösa och onödiga användningen av antibiotika6. Den senare undersökningsmetoden är relativt komplicerad och tidskrävande, med långsam resultatrapportering, vilket inte är gynnsamt för tidig diagnos och behandling av sjukdomar som MGTI. American Urological Association (AUA) föreslår att ytterligare differentiering mellan leukocyter och avvisade celler från könsorganen bör göras när den runda cellkoncentrationen i spermaanalys är större än 1 × 106 celler/ml12. Vissa andrologilaboratorier använder flödescytometri13 eller leukocytantigen (t.ex. CD45) immunocytokemi14 för att undersöka leukocyter. Även om dessa metoder är exakta, är de dyra och tidskrävande, vilket gör storskalig klinisk implementering svår, särskilt i utvecklingsländer.
Peroxidas distribueras i stor utsträckning i olika typer av celler och spelar en avgörande roll för motståndskraften mot oxidativ stressskada. Myeloperoxidas (MPO) är en medlem av underfamiljen peroxidas som vanligtvis uttrycks i immunceller. Det uttrycks starkast i neutrofila azurofila granuler15,16 och uttrycks också i lymfocyter17,18, monocyter och makrofager19. Koncentrationen av leukocyter, särskilt neutrofiler, i sädesvätskan kan erhållas genom att undersöka runda celler som är peroxidaspositiva 7,20. För att göra undersökningsprocessen av leukocyter i sperma ekonomisk, bekväm och effektiv omarbetade vi undersökningsmetoden. Med hjälp av CASA-systemet (datorstödd spermaanalys) kan koncentrationen av leukocyter erhållas inom 60 minuter. Den nya metoden minskar patienternas undersökningskostnader och väntetid för att få resultat, avlastar laboratorieteknikerna och förkortar läkarens diagnos och väntetid för behandling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Orto-toluidin och väteperoxid har ljuskänsliga egenskaper och kan sönderdelas när de utsätts för ljus. För att säkerställa testreagensernas effektivitet rekommenderas att den beredda arbetsvätskan förvaras på en mörk plats.
Spermaprover uppvisar naturligt heterogena egenskaper. I beredningsprocessen av spermaprover är det avgörande att korrekt bedöma spermans förvätskningstillstånd och noggrant homogenisera spermaproverna före varje provtagning för att förbättra testres…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna är tacksamma mot andrologilaboratoriet vid Center for Reproductive Medicine, det tredje anslutna sjukhuset vid Sun Yat-sen University, för att ha tillhandahållit faciliteterna för denna studie. Ingen finansiering var inblandad i utarbetandet av denna artikel.
Materials
| 148 mmol/L ethylenediamine tetraacetic acid disodium (Na2EDTA) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia B |
| 6% (v/v) hydrogen peroxide solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia D |
| Automatic Sperm Class Analyzer – SCA SCOPE | Microptic S.L. | 1222996; Model type: SCA-SCOPE-H | Computer-Assisted Semen Analysis (CASA) equipment |
| Disposable centrifugal tube (1.5 mL) | Zhejiang Gongdong Medical Equipment Co., LTD | 2210009 | Centrifugal tube for Staining process |
| Disposable transfer pipette (3 mL) | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20221101 | Polymer-based pipette |
| Electronic counter | None | None | A multichannel counter |
| Electronic scales | Shanghai Liangping Instrument Co., LTD | D9008084 | MAX = 100 g, e = 10 d, d = 0.01 g |
| Makler counting chamber | Makler | MQ30004 | 0.01 sq.mm, 10 μm deep |
| Optical microscope | Olympus | 3G41067201307 | CX31, 10×40 |
| Ortho-toluidine substrate solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia C |
| Pipet tips(1 mL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 02923205 | 1000 tips/unit, 5 units/case |
| Pipet tips(10 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 00323961 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Pipet tips(200 µL) | Coming Life Sciences (Wujiang) Co.,Ltd | 32822810 | 1000 tips/unit, 20 units/case |
| Saturated ammonium chloride (NH4Cl) solution | ShenZhen HuaKang Biomedical Engineering Co.,LTD | 20230301 | Agentia A |
| SCA counting chamber | Microptic S.L. | 102230608 | 10 µm, 2 Chambers |
| The container for semen sample | Jiangsu Kangjian Medical Supplies Co., LTD | 20230701 | Polymer-based receptacle for semen sample |
| Thermostatic table | Shenzhen MIAOQUAN Instrument Co., LTD | MQ30004 | MQ-300 |
| Transfer pipette (10 µL) | Eppendoff | 3121000.015 | |
| Transfer pipette (1000 µL) | Eppendoff | 3121000.12 | |
| Transfer pipette (200 µL) | Eppendoff | 3121000.082 | |
| Two-dimensional shaker | DragonLab | 822000010000 | VC5A002205 |
References
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reprod Biol Endocrinol. 13, 37 (2015).
- Sharlip, I. D., et al. Best practice policies for male infertility. Fertil Steril. 77 (5), 873-882 (2002).
- Choy, J. T., Eisenberg, M. L. Male infertility as a window to health. Fertil Steril. 110 (5), 810-814 (2018).
- Pellati, D., et al. Genital tract infections and infertility. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 140 (1), 3-11 (2008).
- Rivero, M. J., Kulkarni, N., Thirumavalavan, N., Ramasamy, R. Evaluation and management of male genital tract infections in the setting of male infertility: an updated review. Curr Opin Urol. 33 (3), 180-186 (2023).
- Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: A guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129 (2022).
- Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of ’round cells’ in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
- World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. 5th edn. World Health Organization. , (2010).
- Domes, T., et al. The incidence and effect of bacteriospermia and elevated seminal leukocytes on semen parameters. Fertil Steril. 97 (5), 1050-1055 (2012).
- Aziz, N., Agarwal, A., Lewis-Jones, I., Sharma, R. K., Thomas, A. J. Novel associations between specific sperm morphological defects and leukocytospermia. Fertil Steril. 82 (3), 621-627 (2004).
- Alahmar, A. T. Role of oxidative stress in male infertility: An updated review. J Hum Reprod Sci. 12 (1), 4-18 (2019).
- Schlegel, P. N., et al. Diagnosis and treatment of infertility in men: AUA/ASRM guideline Part I. J Urol. 205 (1), 36-43 (2021).
- Ricci, G., Presani, G., Guaschino, S., Simeone, R., Perticarari, S. Leukocyte detection in human semen using flow cytometry. Hum Reprod. 15 (6), 1329-1337 (2000).
- Brunner, R. J., Demeter, J. H., Sindhwani, P. Review of guidelines for the evaluation and treatment of leukocytospermia in male infertility. World J Mens Health. 37 (2), 128-137 (2019).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annu Rev Immunol. 30, 459-489 (2012).
- Khan, A. A., Alsahli, M. A., Rahmani, A. H. Myeloperoxidase as an active disease biomarker: recent biochemical and pathological perspectives. Med Sci (Basel). 6 (2), 33 (2018).
- Khan, A. A., Rahmani, A. H., Aldebasi, Y. H., Aly, S. M. Biochemical and pathological studies on peroxidases -an updated review). Glob J Health Sci. 6 (5), 87-98 (2014).
- Liu, W. Q., et al. Myeloperoxidase-derived hypochlorous acid promotes ox-LDL-induced senescence of endothelial cells through a mechanism involving beta-catenin signaling in hyperlipidemia. Biochem Biophys Res Commun. 467 (4), 859-865 (2015).
- Nicholls, S. J., Hazen, S. L. Myeloperoxidase and cardiovascular disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (6), 1102-1111 (2005).
- Wolff, H. The biologic significance of white blood cells in semen. Fertil Steril. 63 (6), 1143-1157 (1995).
- Chen, Y., Hashiguchi, N., Yip, L., Junger, W. G. Hypertonic saline enhances neutrophil elastase release through activation of P2 and A3 receptors. Am J Physiol Cell Physiol. 290 (4), C1051-C1059 (2006).
- Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N Engl J Med. 320 (6), 365-376 (1989).
