माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में उत्कीर्ण यकृत स्फेरॉइड की विवो इमेजिंग में
Summary
यहां, हम एक मंच का वर्णन करते हैं जो माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में उत्कीर्ण यकृत स्फेरॉइड के विवो इमेजिंग में गैर-इनवेसिव की अनुमति देता है। वर्कफ़्लो प्राथमिक यकृत कोशिकाओं से स्फेरॉइड उत्पन्न करने से लेकर माउस की आंख में प्रत्यारोपण तक और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा सेलुलर रिज़ॉल्यूशन पर विवो इमेजिंग में फैला है।
Abstract
स्तनधारियों में जिगर के जैव चिकित्सा अध्ययन सेलुलर संकल्प पर विवो noninvasive अनुदैर्ध्य इमेजिंग में के लिए तरीकों की कमी से बाधा उत्पन्न कर रहे हैं. अब तक, स्वस्थानी में यकृत की ऑप्टिकल इमेजिंग इंट्राविटल इमेजिंग द्वारा संभव है, जो सेलुलर स्तर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्रदान करता है, लेकिन कई बार प्रदर्शन नहीं किया जा सकता है और इसलिए, एक ही जानवर में अनुदैर्ध्य रूप से। नॉनविनसिव इमेजिंग विधियों, जैसे कि बायोलुमिनेसेंस, एक ही जानवर पर बार-बार इमेजिंग सत्र की अनुमति देते हैं लेकिन सेल रिज़ॉल्यूशन प्राप्त नहीं करते हैं। इस पद्धति अंतर को संबोधित करने के लिए, हम माउस आंख के पूर्वकाल कक्ष में उत्कीर्ण जिगर spheroids के विवो इमेजिंग में noninvasive के लिए एक मंच विकसित किया है. इस अध्ययन में वर्णित कार्यप्रवाह में, प्राथमिक माउस जिगर spheroids इन विट्रो में उत्पन्न होते हैं और प्राप्तकर्ता चूहों की आंख के पूर्वकाल कक्ष में प्रत्यारोपित, जहां वे परितारिका पर engraft. कॉर्निया एक प्राकृतिक शरीर की खिड़की के रूप में कार्य करता है जिसके माध्यम से हम पारंपरिक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्कीर्ण स्फेरॉइड की छवि बना सकते हैं। स्फेरॉइड आंखों में महीनों तक जीवित रहते हैं, जिसके दौरान कोशिकाओं का स्वास्थ्य और बीमारी के संदर्भ में अध्ययन किया जा सकता है, साथ ही उचित फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग करके बार-बार इमेजिंग सत्रों पर विभिन्न उत्तेजनाओं के जवाब में निगरानी की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल में, हम इस इमेजिंग सिस्टम को लागू करने के लिए आवश्यक कदमों का टूटना प्रदान करते हैं और समझाते हैं कि इसकी क्षमता का सबसे अच्छा उपयोग कैसे करें।
Introduction
स्वास्थ्य और बीमारी के दौरान स्तनधारियों में यकृत समारोह की निगरानी विवो इमेजिंग तकनीकों में उच्च-रिज़ॉल्यूशन, गैर-इनवेसिव की कमी से सीमित है। इस अंग का दृश्य इसके दुर्गम स्थान से बाधित है, और सेलुलर प्रक्रियाओं को एक साथ जोड़ने के लिए, विवो अध्ययनों में अलग-अलग समय बिंदुओं पर जानवरों के बलिदान पर भरोसा करते हैं। इस इमेजिंग सीमा को दरकिनार करने के लिए, बहुत काम इन विट्रो मॉडल पर निर्भर करता है, जिसमें यकृत की तरह microtissues कल्पना कर रहे हैं और एक नियंत्रित वातावरण में अध्ययन कर रहे हैं.
हाल के वर्षों में, त्रि-आयामी संस्कृति प्रणालियों का विकास, जैसे कि यकृत स्फेरॉइड्स, ने यकृत अनुसंधान को सहायता और उन्नत किया है। जिगर spheroids बहुकोशिकीय समुच्चय है कि माइक्रोएन्वायरमेंट और एक निश्चित सीमा तक जिगर के ऊतकों की जटिल सेल सेल बातचीत की नकल कर रहे हैं1 और पारंपरिक मोनोलेयर संस्कृतियों 2,3 पर स्पष्ट लाभ प्रदान करते हैं. जिगर spheroids भी विभिन्न जिगर रोगों 4,5,6 के लिए मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है और रोग तंत्र को समझने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है. फिर भी, इन विट्रो जिगर मॉडल में वर्तमान की प्रमुख सीमाएं विवो परिवेश में एक शारीरिक की कमी और संस्कृति में सीमित उपयोग समय (लगभग 20 दिन)3हैं। लिवर स्फेरॉइड को पहले विवो में विभिन्न साइटों पर प्रत्यारोपित किया गया है, जैसे कि किडनी कैप्सूल7 या इंट्रापेरिटोनली8 के तहत, जो ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए सुलभ नहीं हैं। इंट्रावाइटल लिवर इमेजिंग एक अत्याधुनिक तकनीक है जो सेल-रिज़ॉल्यूशन रीयल-टाइम इमेजिंग की पेशकश करती है। वर्तमान में, यह सीटू यकृत इमेजिंग में केवल बाहरी अंग पर संभव है, जो अत्यधिक आक्रामक और अक्सर टर्मिनल9 है। यद्यपि पेट की खिड़की की फिटिंग बार-बार यकृत इमेजिंग सत्रों की अनुमति देगी, लेकिन इसमें जटिल सर्जरी और बाद की देखभाल शामिल है।
सेलुलर संकल्प पर अनुदैर्ध्य निगरानी प्रदर्शन करने के लिए, हम चूहों की आंख (एसीई) के पूर्वकाल कक्ष में जिगर spheroids के प्रत्यारोपण का पता लगाया, जहां जिगर की तरह ऊतक एक शारीरिक मील का पत्थर में engrafted है, शरीर उत्तेजनाओं से जुड़ा हुआ है, और ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए सुलभ. कॉर्निया एक पारदर्शी ऊतक है और एक खिड़की के रूप में कार्य करता है जिसके माध्यम से आईरिस पर उत्कीर्ण सूक्ष्म ऊतकों को गैर-आक्रामक और अनुदैर्ध्य रूप से कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा चित्रित किया जा सकता है। यहाँ, हम जिगरspheroids 10 के विवो इमेजिंग में के लिए इस नव विकसित मंच का एक कार्यप्रवाह प्रस्तुत करते हैं. यह प्रोटोकॉल इसके कार्यान्वयन के लिए एक कदम-दर-चरण मार्गदर्शिका है, (1) प्राथमिक माउस यकृत कोशिकाओं के निष्कर्षण और यकृत स्फेरॉइड के इन विट्रो गठन में, (2) प्राप्तकर्ता चूहों के एसीई में यकृत स्फेरॉइड का प्रत्यारोपण, और (3) संवेदनाहारी चूहों में उत्कीर्ण यकृत स्फेरॉइड के विवो इमेजिंग में। इसके अलावा, हम इस इमेजिंग प्लेटफॉर्म की कुछ संभावनाओं और अनुप्रयोगों का प्रदर्शन करेंगे।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल एसीई में उत्कीर्ण यकृत स्फेरॉइड के विवो इमेजिंग में इंट्राओकुलर के लिए एक उपन्यास मंच का वर्णन करता है। एसीई पहले इस तरह के अग्नाशय आइलेट्स11,12 के रूप में अन्य अंग व्युत्पन्न microtissues के एक प्रत्यारोपण साइट के रूप में इस्तेमाल किया गया है, अपने अद्वितीय engraftment microenvironment के कारण, वाहिकाओं, नसों, और ऑक्सीजन, और कॉर्निया के माध्यम से इमेजिंग के लिए उपयोग किया जा रहा है. जबकि इंट्राविटल लीवर इमेजिंग सीटू में कोशिकाओं और प्रक्रियाओं के दृश्य को सक्षम बनाता है, अनुदैर्ध्य निगरानी संभव नहीं है। पेट की खिड़की के माध्यम से लिवर इमेजिंग जटिल सर्जरी पर जोर देती है, और शरीर के भीतर अंग की गति समय के साथ एकल-कोशिका ट्रैकिंग को मुश्किल बनाती है। इसलिए, यह उपन्यास इमेजिंग विधि एकल-कोशिका संकल्प पर यकृत कोशिकाओं की गैर-आक्रामक, अनुदैर्ध्य निगरानी को सक्षम बनाती है।
इस प्रोटोकॉल को तीन भागों में बांटा गया है। सबसे पहले दो-चरण कोलेजन छिड़काव के माध्यम से प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का अलगाव है, जो चर्नी-नातन एट अल.13से अनुकूलित है, इस अंतर के साथ कि हम संवेदनाहारी जीवित जानवरों के बजाय मृत माउस पर यकृत छिड़काव करते हैं। यह भिन्नता कुछ फायदे लाती है, जैसे कि कम नैतिक विचार और जीव में संज्ञाहरण अवशेषों से बचना। इस काम में, हम अलगाव के हेपेटोसाइट समृद्ध अंश से जिगर spheroids उत्पन्न, लेकिन यह विविध संरचना14,15 के coculture spheroids बनाने के लिए अन्य विशेष प्रोटोकॉल का उपयोग कर अन्य nonparenchymal सेल आबादी को अलग करने की क्षमता को बाहर नहीं करता है.
इस प्रोटोकॉल के दूसरे भाग प्राप्तकर्ता चूहों की ऐस में जिगर spheroids के प्रत्यारोपण शामिल. यह एक त्वरित (10 मिनट से कम) और सरल सर्जरी है जो एनेस्थेटाइज्ड चूहों में की जाती है और इसके लिए किसी भी पोस्ट-ऑपरेटिव उपचार की आवश्यकता नहीं होती है। कॉर्निया पंचर स्व-सील और 3-5 दिनों में ठीक हो जाता है। कभी-कभी, उपचार प्रक्रिया के दौरान, चीरे के आसपास कुछ धुंधला देखा जाता है, लेकिन यह कुछ दिनों के भीतर साफ हो जाता है। हमने संचालित जानवरों की आंखों में पूर्वकाल सिनेचिया के मामलों का अनुभव नहीं किया है। हम एक स्वच्छ लेकिन खुली हवा में प्रयोगशाला में और संचालित आंखों में संक्रमण के मुद्दों के बिना प्रत्यारोपण प्रक्रियाएं करते हैं। आंखों में स्फेरॉइड का टीकाकरण और एनग्राफ्टमेंट दृष्टि से समझौता नहीं करता है या प्राप्तकर्ता जानवर के व्यवहार को नहीं बदलता है। इस प्रोटोकॉल में, हम प्रत्यारोपण सर्जरी और विवो इमेजिंग दोनों के लिए आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण का उपयोग करते हैं, जो चूहों में अच्छी तरह से सहन किया जाता है। इसकी खुराक पर निर्भर प्रभाव के कारण, इसे पूरी प्रक्रियाओं में आसानी से समायोजित किया जा सकता है और नींद और जागने के समय को कम करने का लाभ लाता है। हालांकि, वैकल्पिक इंजेक्शन एनेस्थेटिक्स का उपयोग किया जा सकता है। प्रत्यारोपण के बाद, हम आम तौर पर 1 महीने की अनुमति देते हैं स्फेरॉइड पूरी तरह से engraft करने के लिए, संवहनी हो जाते हैं, और innervated, उपचार हस्तक्षेप प्रदर्शन करने से पहले और vivo इमेजिंग में . हमने यह भी दिखाया है कि प्रत्यारोपण और engraftment मानव जिगर spheroids और immunocompromised प्राप्तकर्ता चूहों10 का उपयोग कर संभव है.
इस विधि का तीसरा भाग एसीई में उत्कीर्ण यकृत स्फेरॉइड की विवो इमेजिंग में है। यह प्रोटोकॉल विवो इमेजिंग सेटअप में वर्णन करता है, जो आमतौर पर अनुसंधान इमेजिंग सुविधाओं में पाए जाने वाले माइक्रोस्कोपी उपकरण का उपयोग करता है। इसके अलावा, विशेष सामग्री, जैसे माउस हेड-होल्डर और प्लास्टिक प्रवेशनी, अब व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं। इस इमेजिंग सेटअप के साथ, हम जेड-वर्गों पर कब्जा करने और लेजर प्रवेश और प्रतिदीप्ति का पता लगाने की गहराई के आधार पर अंडाकार आकृति का त्रि-आयामी पुनर्निर्माण प्राप्त करने में सक्षम हैं। उत्कीर्ण यकृत स्फेरॉइड में सेलुलर फ़ंक्शन की निगरानी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के दृश्य पर निर्भर करती है जो सेल प्रकार, सेलुलर कार्यों और गतिशीलता पर रिपोर्ट करती है। इस प्रकार, इस इमेजिंग प्लेटफॉर्म का उपयोग करके अकेले या संयोजन में विभिन्न तौर-तरीकों का उपयोग करके शोषण किया जा सकता है: (1) फ्लोरोसेंट जांच को अंतःशिरा रूप से प्रशासित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, लेबल और ट्रैक कोशिकाओं के साथ-साथ कार्यात्मक रंगों के लिए एंटीबॉडी; (2) लिवर स्फेरॉइड रिपोर्टर माउस मॉडल से अलग कोशिकाओं से उत्पन्न किया जा सकता है जो यकृत-विशिष्ट फ्लोरोसेंट प्रोटीन को व्यक्त करते हैं, उदाहरण के लिए, एफयूसीसीआई यकृत स्फेरॉइड जो सेल चक्र गतिशीलता पर रिपोर्ट करते हैं; (3) इन विट्रो में जिगर spheroids के गठन अभिकर्मक या पारगमन के साथ जोड़ा जा सकता है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन और biosensors के साथ spheroids लैस करने के लिए. जैसे, एडेनो से जुड़े वायरस। हमारी प्रयोगात्मक सेटिंग्स में और उत्तेजना के लिए एक एकल फोटॉन का उपयोग करके, इमेजिंग गहराई है कि प्राप्त करने के लिए संभव है मोटे तौर पर 60-100 माइक्रोन है. हालांकि, यह लेजर शक्ति और मल्टीपोटन इमेजिंग उपलब्धता, प्रतिदीप्ति जांच उत्सर्जन विशेषताओं और डिटेक्टरों की संवेदनशीलता, साथ ही आंख के कोण जिसमें गोलाकार उत्कीर्ण है पर निर्भर है. इमेजिंग अधिग्रहण के बाद, डाउनस्ट्रीम छवि विश्लेषण छवि जे और इमारिस जैसे लोकप्रिय कार्यक्रमों का उपयोग करके किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, एफयूसीसीआई रिपोर्टर के मामले में, हरे रंग में सेल-चक्र सक्रिय कोशिकाओं को गिना जा सकता है और उत्कीर्ण गोलाकार के भीतर सेल-चक्र गतिविधि का आकलन करने के लिए कुल लाल कोशिकाओं की संख्या के विपरीत किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, एसीई-इमेजिंग प्लेटफॉर्म पदार्थों को आंखों पर लागू करने की अनुमति देता है (आंखों की बूंदों के रूप में) या ग्राफ्ट का इलाज करने और इसकी प्रतिक्रिया की निगरानी करने के लिए सीधे एसीई में इंजेक्ट किया जाता है। पोस्ट-मॉर्टम, प्रत्यारोपित स्फेरॉइड को आसानी से मैनुअल माइक्रोडिसेक्शन द्वारा पुनर्प्राप्त किया जा सकता है और पूर्व विवो तकनीकों, जैसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला, ट्रांसक्रिप्टोमिक विश्लेषण, आदि10द्वारा बहुमूल्य जानकारी प्रदान कर सकता है।
इस तकनीक की कुछ सीमाएँ हैं। पहला यह है कि हमारे अनुभव से, प्राप्तकर्ता चूहों को अल्बिनो होना चाहिए, अर्थात, गैर-रंजित आईरिस होना चाहिए। एनग्राफ्टमेंट पर, लिवर स्फेरॉइड आईरिस कोशिकाओं के एक मोनोलेयर द्वारा कवर हो जाते हैं, जो स्फेरॉइड की व्यवहार्यता या कार्य को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन आईरिस कोशिकाओं में वर्णक इमेजिंग को रोकता है। एक दूसरा विचार संवेदनाहारी चूहों में इंट्राओकुलर इमेजिंग के दौरान स्थिरता है। विवो इमेजिंग सत्र के दौरान, संज्ञाहरण एकाग्रता और जानवर की सांस लेने बारीकी से आंदोलन को कम करने के लिए निगरानी की जानी चाहिए. फिर भी, यहां इंगित इमेजिंग सेटिंग्स का उपयोग करके, हम एकल-सेल स्तर पर उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग प्राप्त करने में सक्षम हैं।
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल चूहों की आंखों में उत्कीर्ण जिगर की तरह ऊतक के विवो इमेजिंग मंच में एक noninvasive के कार्यान्वयन का वर्णन करता है. हम आसान प्रक्रियाओं, सामान्य उपकरणों और सस्ती सामग्री का उपयोग करते हैं, जिससे यह कई जांचकर्ताओं के लिए एक प्राप्य दृष्टिकोण बन जाता है। यह मॉडल इन विट्रो 3 डी-लिवर स्फेरॉइड के फायदों को इन विवो मील के पत्थर और एसीई द्वारा प्रदान की गई ऑप्टिकल पहुंच के साथ जोड़ता है ताकि बुनियादी अनुसंधान और पूर्व-नैदानिक सेटिंग्स में यकृत शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मंच बनाया जा सके।
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम स्वीडिश मधुमेह एसोसिएशन द्वारा समर्थित किया गया, Karolinska Institutet के फंड, स्वीडिश अनुसंधान परिषद, नोवो Nordisk फाउंडेशन, परिवार Erling-Persson फाउंडेशन, करोलिंस्का Institutet में मधुमेह में सामरिक अनुसंधान कार्यक्रम, परिवार Knut और ऐलिस Wallenberg फाउंडेशन, जोनास & क्रिस्टीना एएफ Jochnick फाउंडेशन, Diabetology और ERC-2018-AdG 834860-EYELETS के लिए स्वीडिश एसोसिएशन. आकृति चित्र FL-B द्वारा BioRender.com का उपयोग करके बनाए गए थे।
Materials
| 27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
| AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
| Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
| Absorbent pad | Attends | 203903 | |
| Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
| B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
| BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
| Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
| Cell lifter | Corning | 3008 | |
| Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
| Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
| FBS | Gibco | N/A | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
| Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
| HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
| HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
| HEPES | Gibco | 15630080 | |
| Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
| Isoflurane | Baxter | N/A | |
| Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
| Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
| Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
| Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
| Oculentum simplex | APL | N/A | |
| PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
| PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
| PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
| pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
| Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
| Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
| Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
| Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
| Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
| Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
| Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
| Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
| Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
| Viscotears | Novartis | N/A | |
| William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |
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