Her beskriver vi en plattform som tillater ikke-invasiv de vivo-avbildning av leversfæroider innpodet i museøyets fremre kammer. Arbeidsflyten spenner fra å generere sfæroider fra primære leverceller til transplantasjon i museøyet og de vivo-avbildning ved cellulær oppløsning ved konfokalmikroskopi.
Biomedisinske studier av leveren hos pattedyr hindres av mangel på metoder for in vivo ikke-invasiv langsgående avbildning ved cellulær oppløsning. Hittil er optisk avbildning av leveren in situ mulig ved intravital bildebehandling, som tilbyr høyoppløselig avbildning på mobilnivå, men kan ikke utføres flere ganger og derfor langsgående i samme dyr. Ikke-invasive bildebehandlingsmetoder, som bioluminescens, tillater gjentatte bildebehandlingsøkter på samme dyr, men oppnår ikke celleoppløsning. For å løse dette metodegapet har vi utviklet en plattform for ikke-invasiv de vivo-avbildning av leversfæroider som er podet i museøyets fremre kammer. I arbeidsflyten beskrevet i denne studien genereres primære museleversfæroider in vitro og transplanteres inn i det fremre kammeret i øyet til mottakermus, hvor de engraft på iris. Hornhinnen fungerer som et naturlig kroppsvindu gjennom hvilket vi kan avbilde de engrafted sfæroider ved konvensjonell konfokal mikroskopi. Sfæroidene overlever i flere måneder i øyet, hvor cellene kan studeres i sammenheng med helse og sykdom, samt overvåkes som respons på forskjellige stimuli over gjentatte bildebehandlingsøkter ved hjelp av passende fluorescerende prober. I denne protokollen gir vi en oversikt over de nødvendige trinnene for å implementere dette bildebehandlingssystemet og forklarer hvordan du best kan utnytte potensialet.
Overvåking av leverfunksjon hos pattedyr under helse og sykdom er begrenset av mangel på høyoppløselige, ikke-invasive in vivo bildebehandlingsteknikker. Visualiseringen av dette organet hindres av sin utilgjengelige plassering, og for å sette sammen cellulære prosesser, er in vivo-studier avhengige av ofring av dyr på forskjellige tidspunkter. For å omgå denne bildebegrensningen er mye arbeid avhengig av in vitro-modeller , hvor leverlignende mikrovev visualiseres og studeres i et kontrollert miljø.
I de senere år har utviklingen av tredimensjonale kultursystemer, som leversfæroider, hjulpet og avansert leverforskning. Leversfæroider er multicellulære aggregater som etterligner mikromiljøet og komplekse celle-celle-interaksjoner av levervev til en viss grad1 og gir klare fordeler i forhold til tradisjonelle monolagskulturer 2,3. Lever sfæroider brukes også som modeller for ulike leversykdommer 4,5,6 og har vært medvirkende til å forstå sykdomsmekanismer. Likevel er de viktigste begrensningene ved dagens in vitro levermodeller mangelen på et fysiologisk in vivo-miljø og den begrensede utnyttelsestiden i kultur (rundt 20 dager)3. Leversfæroider har tidligere blitt transplantert til forskjellige steder in vivo, for eksempel under nyrekapsel7 eller intraperitonealt8, som ikke er tilgjengelige for optisk avbildning. Intravital leveravbildning er en toppmoderne teknikk som tilbyr celleoppløsning i sanntid. For tiden er denne in situ leveravbildningen bare mulig på det eksterioriserte organet, som er svært invasivt og ofte terminal9. Selv om montering av et bukvindu vil tillate gjentatte leveravbildningsøkter, innebærer det komplisert kirurgi og etterbehandling.
For å utføre langsgående overvåking ved cellulær oppløsning, utforsket vi transplantasjon av leversfæroider i øyets fremre kammer (ACE) hos mus, hvor det leverlignende vevet er innpodet i et fysiologisk miljø, koblet til kroppsstimuli og tilgjengelig for optisk avbildning. Hornhinnen er et gjennomsiktig vev og fungerer som et vindu gjennom hvilket mikrovev innpodet på iris kan avbildes ikke-invasivt og langsgående ved konfokal mikroskopi. Her presenterer vi en arbeidsflyt av denne nyutviklede plattformen for in vivo avbildning av leversfæroider10. Denne protokollen er en trinnvis veiledning for implementeringen, delt inn i (1) ekstraksjon av primære leverceller fra mus og in vitro-dannelse av leversfæroider, (2) transplantasjon av leversfæroider i ACE hos mottakermus, og (3) in vivo-avbildning av transplanterte leversfæroider i bedøvede mus. Videre vil vi vise frem noen av mulighetene og applikasjonene til denne bildebehandlingsplattformen.
Denne protokollen beskriver en ny plattform for intraokulær in vivo avbildning av leversfæroider innpodet i ACE. ACE har tidligere blitt brukt som transplantasjonssted for andre organavledede mikrovev, for eksempel bukspyttkjerteløyer11,12, på grunn av sitt unike engraftmentmikromiljø, som er rik på kar, nerver og oksygen, og tilgangen til avbildning gjennom hornhinnen. Mens intravital leveravbildning muliggjør visualisering av celler og prosesser in situ, er langsgående overvåking ikke mulig. Leveravbildning gjennom et bukvindu innebærer komplisert kirurgi, og bevegelsen av organet i kroppen gjør enkeltcellesporing over tid vanskelig. Derfor muliggjør denne nye bildebehandlingsmetoden ikke-invasiv, langsgående overvåking av leverceller ved enkeltcelleoppløsning.
Denne protokollen er delt inn i tre deler. Først er isoleringen av primære hepatocytter via to-trinns kollagenase perfusjon, tilpasset fra Charni-Natan et al.13, med den forskjellen at vi utfører leverperfusjonen på den døde musen i stedet for de bedøvede levende dyrene. Denne variasjonen gir visse fordeler, for eksempel færre etiske hensyn og unngåelse av anestesirester i organismen. I dette arbeidet genererer vi leversfæroider fra den hepatocytberikede fraksjonen av isolasjonen, men dette utelukker ikke potensialet for å isolere andre ikke-parenkymale cellepopulasjoner ved hjelp av andre spesialiserte protokoller for å lage kokultursfæroider med forskjellig sammensetning14,15.
Den andre delen av denne protokollen innebærer transplantasjon av leversfæroidene i ACE hos mottakermus. Dette er en rask (under 10 min) og enkel kirurgi utført i bedøvede mus og krever ingen postoperativ behandling. Hornhinnen punkterer seg selv og helbreder over 3-5 dager. Av og til, under helbredelsesprosessen, observeres noe tåke rundt snittet, men dette rydder innen få dager. Vi har ikke opplevd tilfeller av fremre synechia i øynene til opererte dyr. Vi utfører transplantasjonsprosedyrene i et rent, men utendørs laboratorium og uten problemer med infeksjoner i de opererte øynene. Inokulering og engraftment av sfæroider i øyet kompromitterer ikke visjonen eller endrer mottakerdyrets oppførsel. I denne protokollen bruker vi isoflurananestesi både til transplantasjonskirurgi og in vivo avbildning, noe som tolereres godt hos mus. På grunn av sin doseavhengige effekt kan den enkelt justeres gjennom prosedyrene og gir fordelen av å redusere søvn- og oppvåkningstider. Imidlertid kan alternative injiserbare anestetika brukes. Etter transplantasjon tillater vi vanligvis 1 måned for sfæroidene å fullstendig engraft, bli vaskularisert og innervert, før vi utfører behandlingsintervensjoner og in vivo avbildning. Vi har også vist at transplantasjon og transplantasjon er mulig ved bruk av humane leversfæroider og immunkompromitterte mottakermus10.
Den tredje delen av denne metoden er in vivo-avbildning av de transplanterte leversfæroidene i ACE. Denne protokollen beskriver in vivo bildeoppsettet, som bruker mikroskopiutstyr som ofte finnes i forskningsbildeanlegg. Videre er de spesialiserte materialene, som musehodeholderen og plastkanylen, nå kommersielt tilgjengelige. Med dette bildeoppsettet er vi i stand til å fange z-seksjoner og få en tredimensjonal rekonstruksjon av sfæroidarkitekturen, avhengig av dybden av laserpenetrasjon og fluorescensdeteksjon. Overvåking av cellulær funksjon i de transplanterte leversfæroidene er avhengig av visualisering av fluorescerende proteiner som rapporterer om celletyper, cellulære funksjoner og dynamikk. Dermed kan denne bildebehandlingsplattformen utnyttes ved hjelp av forskjellige modaliteter, alene eller i kombinasjon: (1) Fluorescerende prober kan administreres intravenøst, for eksempel antistoffer mot etikett og sporceller samt funksjonelle fargestoffer; (2) Leversfæroider kan genereres fra celler isolert fra reportermusemodeller som uttrykker leverspesifikke fluorescerende proteiner, for eksempel FUCCI leversfæroider som rapporterer om cellesyklusdynamikk; (3) Dannelsen av leversfæroider in vitro kan kombineres med transfeksjon eller transduksjon for å utstyre sfæroidene med fluorescerende proteiner og biosensorer. f.eks. adenoassosierte virus. I våre eksperimentelle omgivelser og ved å bruke et enkelt foton for eksitasjon, er bildedybden som er mulig å oppnå omtrent 60-100 μm. Dette er imidlertid avhengig av tilgjengeligheten av laserkraft og multifotonbilde, utslippsegenskaper for fluorescenssonden og følsomheten til detektorene, samt vinkelen på øyet der sfæroiden er innpodet. Etter bildeinnsamling kan nedstrøms bildeanalyse utføres ved hjelp av populære programmer som Image J og Imaris. For eksempel, når det gjelder FUCCI-reporteren, kan cellesyklusaktive celler i grønt telles og kontrasteres til antall totale røde blodlegemer for å vurdere cellesyklusaktivitet i den transplanterte sfæroiden. I tillegg tillater ACE-bildebehandlingsplattformen at stoffer påføres øyet (i form av øyedråper) eller injiseres direkte i ACE for å behandle transplantatet og overvåke dets reaksjon. Post-mortem kan de transplanterte sfæroidene lett hentes ved manuell mikrodisseksjon og kan gi verdifull informasjon ved ex vivo-teknikker , for eksempel immunfluorescensfarging, transkriptomisk analyse, etc.10.
Denne teknikken har visse begrensninger. Den første er at fra vår erfaring må mottakermusene være albino, det vil si ha ikke-pigmentert iris. Ved engraftment blir leversfæroidene dekket av et monolag av irisceller, noe som ikke påvirker levedyktigheten eller funksjonen til sfæroidene, men pigmentet i iriscellene forhindrer avbildning. En annen vurdering er stabiliteten under intraokulær avbildning i bedøvede mus. Under in vivo-avbildningsøktene må anestesikonsentrasjonen og pusten til dyret overvåkes nøye for å minimere bevegelse. Likevel, ved å bruke bildeinnstillingene som er angitt her, er vi i stand til å oppnå høyoppløselig bildebehandling på enkeltcellenivå.
For å oppsummere, beskriver denne protokollen implementeringen av en ikke-invasiv in vivo bildebehandlingsplattform av leverlignende vev innpodet i musens øyne. Vi bruker enkle prosedyrer, felles utstyr og rimelige materialer, noe som gjør det til en oppnåelig tilnærming for mange etterforskere. Denne modellen kombinerer fordelene med in vitro 3D-leversfæroider med in vivo-miljøet og optisk tilgjengelighet levert av ACE for å skape en verdifull plattform for å studere leverfysiologi og patologi i grunnforskning og prekliniske omgivelser.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av Diabetesforbundet, Karolinska Institutets fond, Vetenskapsrådet, Novo Nordisk-stiftelsen, Familien Erling-Persson Foundation, Strategisk forskningsprogram i diabetes ved Karolinska Institutet, Familien Knut og Alice Wallenberg-stiftelsen, Jonas & Christina af Jochnick-stiftelsen, Svensk forening for diabetologi og ERC-2018-ADG 834860-EYELETS. Figurtegningene ble laget av FL-B ved hjelp av BioRender.com.
27 G butterfly needle | Venofix | 4056388 | |
AAV8-CAG-GFP | Charles River | CV17169-AV9 | Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation |
Absolute and 70% ethanol | N/A | N/A | |
Absorbent pad | Attends | 203903 | |
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson | #003574 and #007914 | Mice obtained from in-house breeding |
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J) | Jackson | #000058 | Mice obtained from in-house breeding |
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH | INFRAFRONTIER/EMMA | EM:08395 | Mice obtained from in-house breeding |
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in | BD Medical | 381212 | |
Borosillicate standard glass cappilaries | World Precision Instruments | 1B150-4 | |
Cell lifter | Corning | 3008 | |
Cell strainer, 70 µm | Falcon | 352350 | |
Custom-made metal plate | Hardware store | N/A | |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
Dual-Stage Glass Micropipette Puller | Narshige | Model PC-100 | |
EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
Electric heating pad | Hardware store | N/A | |
FBS | Gibco | N/A | |
GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
Green CMFDA | Abcam | ab145459 | Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS |
Hamilton syringe | Hamilton | 81242 | Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL |
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red | Gibco | 14175095 | |
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective | Leica | N/A | |
HEPES | Gibco | 15630080 | |
Induction chamber 0.8 L | Univentor | 8329001 | |
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G) | Gibco | 41400045 | |
Isoflurane | Baxter | N/A | |
Lectin DyLight-649 | Invitrogen | L32472 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Liberase TM Research Grade | Sigma-Aldrich | 5401127001 | |
Microelectrode beveler | World Precision Instruments | Model BV-10 | |
Mouse head-holder and gas mask | Narshige | Model SGM-4 | |
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate | Thermo Fisher | 174929 | |
Oculentum simplex | APL | N/A | |
PBS 10x | Gibco | 14080055 | |
PBS 1x; no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Percoll | Sigma-Aldrich | P1644 | |
Peristaltic pump | Ismatec | Model ISM795 | |
PharMed BPT Pump Tubing | VWR | VERN070540-07 | Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm |
pHrodo Red-LDL | Invitrogen | L34356 | Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse |
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing | Smiths Medical | 800/100/140 | Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm |
Silicone dissection mat | Hardware store | N/A | |
Sodium chloride 0.9% | Braun | N/A | |
Solid Universal Joint | Narshige | Model UST-2 | |
Stereomicroscope | Leica | Model M80 | |
Suspension culture dish 35 mm | Sarstedt | 833900500 | |
Temgesic | Indivor | N/A | Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse |
Translucent Silicone Tubing | VWR | 228-1450 | Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm |
Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
Univentor 400 Anesthesia unit | Univentor | 8323001 | |
Upright laser scanning confocal microscope | Leica | Model TCS SP5 II | |
Viscotears | Novartis | N/A | |
William's E Medium; no glutamine, phenol red | Gibco | 22551089 |