In vivo-avbildning av leversfäroider inympade i den främre kammaren i musögat

Summary

Här beskriver vi en plattform som möjliggör icke-invasiv in vivo-avbildning av leversfäroider inympade i den främre kammaren i musögat. Arbetsflödet sträcker sig från generering av sfäroider från primära leverceller till transplantation i musögat och in vivo-avbildning med cellulär upplösning genom konfokalmikroskopi.

Abstract

Biomedicinska studier av levern hos däggdjur hindras av att det saknas metoder för in vivo icke-invasiv longitudinell avbildning med cellulär upplösning. Hittills har optisk avbildning av levern in situ varit möjlig genom intravital avbildning, som erbjuder högupplöst avbildning på cellulär nivå men som inte kan utföras flera gånger och därför i längdriktningen på samma djur. Icke-invasiva avbildningsmetoder, såsom bioluminiscens, tillåter upprepade avbildningssessioner på samma djur men uppnår inte cellupplösning. För att ta itu med denna metodlucka har vi utvecklat en plattform för icke-invasiv in vivo-avbildning av leversfäroider transplanterade i den främre kammaren i musögat. I det arbetsflöde som beskrivs i denna studie genereras primära leversfäroider från möss in vitro och transplanteras in i den främre kammaren i ögat hos mottagande möss, där de transplanterar på iris. Hornhinnan fungerar som ett naturligt kroppsfönster genom vilket vi kan avbilda de transplanterade sfäroiderna med konventionell konfokalmikroskopi. Sfäroiderna överlever i månader i ögat, under vilka cellerna kan studeras i samband med hälsa och sjukdom, samt övervakas som svar på olika stimuli över upprepade avbildningssessioner med hjälp av lämpliga fluorescerande sonder. I det här protokollet ger vi en uppdelning av de nödvändiga stegen för att implementera detta bildsystem och förklarar hur man bäst utnyttjar dess potential.

Introduction

Övervakningen av leverfunktionen hos däggdjur under hälsa och sjukdom begränsas av bristen på högupplösta, icke-invasiva in vivo-avbildningstekniker . Visualiseringen av detta organ hindras av dess otillgängliga läge, och för att pussla ihop cellulära processer förlitar sig in vivo-studier på att djur offras vid olika tidpunkter. För att kringgå denna avbildningsbegränsning förlitar sig mycket arbete på in vitro-modeller , där leverliknande mikrovävnader visualiseras och studeras i en kontrollerad miljö.

Under de senaste åren har utvecklingen av tredimensionella odlingssystem, såsom leversfäroider, hjälpt och främjat leverforskningen. Leversfäroider är flercelliga aggregat som i viss utsträckning efterliknar mikromiljön och komplexa cell-cellinteraktioner i levervävnad¹ och erbjuder klara fördelar jämfört med traditionella monolagerkulturer ^2,3. Leversfäroider används också som modeller för olika leversjukdomar ^4,5,6 och har varit avgörande för att förstå sjukdomsmekanismer. Viktiga begränsningar med de nuvarande in vitro-levermodellerna är dock avsaknaden av en fysiologisk in vivo-miljö och den begränsade användningstiden i odling (cirka 20 dagar)³. Leversfäroider har tidigare transplanterats till olika platser in vivo, till exempel under njurkapseln⁷ eller intraperitonealt⁸, som inte är tillgängliga för optisk avbildning. Intravital leveravbildning är en toppmodern teknik som erbjuder cellupplösning i realtid. För närvarande är denna in situ leveravbildning endast möjlig på det exterioriserade organet, som är mycket invasivt och ofta terminal⁹. Även om montering av ett bukfönster skulle möjliggöra upprepade leveravbildningssessioner, innebär det komplex kirurgi och eftervård.

För att utföra longitudinell övervakning med cellulär upplösning utforskade vi transplantation av leversfäroider till den främre kammaren i ögat (ACE) hos möss, där den leverliknande vävnaden är inympad i en fysiologisk miljö, kopplad till kroppens stimuli och tillgänglig för optisk avbildning. Hornhinnan är en genomskinlig vävnad och fungerar som ett fönster genom vilket mikrovävnader som är transplanterade på iris kan avbildas icke-invasivt och longitudinellt genom konfokalmikroskopi. Här presenterar vi ett arbetsflöde för denna nyutvecklade plattform för in vivo avbildning av leversfäroider¹⁰. Detta protokoll är en steg-för-steg-guide för dess implementering, uppdelad i (1) extraktion av primära leverceller från möss och in vitro-bildning av leversfäroider, (2) transplantation av leversfäroider till ACE hos mottagande möss och (3) in vivo-avbildning av transplanterade leversfäroider i sövda möss. Dessutom kommer vi att visa upp några av möjligheterna och tillämpningarna av denna bildbehandlingsplattform.

Protocol

Alla försök som utförs på djur är godkända av Försöksetiska kommittén vid Karolinska Institutet. 1. Extraktion av primära leverceller från möss och generering av leversfäroider in vitro FörberedelseFör kanylering, leverresektion och isolering av primära leverceller, bereds följande sterila material eller engångsmaterial utöver serologiska pipetter och centrifugrör (figur 1A): peristaltisk pump, centrifug med svängskopa, absorberande dyna, dissektionsmatta, två pincetter med böjd spets, kirurgisk sax, en 27 G fjärilsnål, en 70 μm cellsil, en celllyftare, en 100 mm petriskål. cellräkningskammare och 96-brunnar, U-formade mikroplattor. Bered de lösningar som används vid leverperfusion, isolering av primära leverceller och generering av leversfäroider enligt tabell 1.ANM.: Uppslutningsbufferten och gradientlösningen ska beredas på nytt sätt. Ställ in perfusionssystemet som består av en peristaltisk pump som leder lösningar från det 42 °C varma vattenbadet till levern (figur 1A). Den högre temperaturen i vattenbadet säkerställer att buffertarna når levern vid den optimala temperaturen på 37 °C. Anpassa detta beroende på rörets längd och rumstemperaturen (RT). För kanyleringen, montera en 27 G fjärilsnål i änden av röret. Förvara det platteringsmedium som används i de sista isoleringsstegen vid 4 °C. ProcedurFörvärm följande lösningar i 42 °C vattenbad i 50 ml centrifugrör: 40 ml PBS, 20 ml perfusionsbuffert och 12 ml digestionsbuffert. För att rengöra och värma pumprören, cirkulera cirka 20 ml av den förvärmda PBS:en. Byt slangen till perfusionsbufferten, fyll röret och fjärilsnålen och ställ in flödeshastigheten på 4 ml/min. Se till att det inte finns några bubblor i slangen under buffertbyten under hela protokollet. Avliva musen genom cervikal luxation och använd nålar för att fästa lemmarna på dissektionsbrädan. Blöt bukens päls med 70 % etanol och dissekera den för att komma åt matsmältningsorganen. Flytta tarmarna åt höger för att exponera portvenen och den nedre hålvenen (Figur 1B). Kanylera hålvenen ungefär halvvägs på dess längd med nålen i horisontellt läge, se till att den är stabil och starta pumpen. När levern börjar blåsas upp, eller vita prickar dyker upp i de närmare loberna, skär av portvenen så att blod- och perfusionsbufferten kan rinna ut. Levern ska börja blekna omedelbart. Uppmuntra rensning med böjd pincett för att klämma fast portvenen med 5 s intervall. Upprepa steg 1.2.9 tills levern är gul och tömd på blod (ca 15-20 ml perfusionsbuffert). Stoppa den peristaltiska pumpen för att byta slangen till rötningsbufferten och starta om pumpen. När rötningsbufferten når levern, minska flödeshastigheten till 2,5 ml/min.OBS: Fenolrött i rötningsbufferten gör det möjligt att diskriminera dess ankomst till levern och möjliggör justering av pumpparametrar under behandlingen. För att uppmuntra bufferten att nå alla leverlober och säkerställa korrekt nedbrytning, upprepa steg 1.2.9 flera gånger. Stoppa flödet i den peristaltiska pumpen när rötningsbufferten är uttömd eller levern ser tillräckligt smält ut.OBS: Matsmältningsgraden kan övervakas visuellt genom att försiktigt nypa leverloberna med en pincett och kontrollera om det finns små märken på vävnaden. Levern blir också tunn. För att extrahera levern, skär av leverligamenten och anslutningarna i bukhålan, sikta på att ta bort den helt, och placera den i petriskålen som innehåller 10 ml kall pläteringsmedium (tabell 1). Efter att ha tagit bort gallblåsan, gör små nypningar på loberna med en pincett och riv lätt av leverkapseln. Genom att skaka levern i skålen kan du observera celler som strömmar ut i mediet. Håll levern stadigt med en pincett och dra försiktigt celllyftaren längs loberna för att frigöra cellerna.OBS: Korrekt interlobulär nedbrytning kommer att leda till cellsuspension i mediet, inte vävnadsfragment. Använd en serologisk pipett, samla upp cellsuspensionen från petriskålen och filtrera genom den 70 μm stora cellsilen som är placerad på ett 50 ml centrifugrör. Använd färska plattor för att tvätta skålen med smälta leverceller och överför dem till filtret. Centrifugera vid 50 x g i 5 minuter vid 4 °C för att pelletera cellerna. Ta bort supernatanten, lämna cirka 1 ml för att täcka cellpelleten, snurra röret för att återsuspendera cellerna och tillsätt sedan gradvis 10 ml kallpläteringsmedium. Tillsätt 10 ml gradientlösning till cellsuspensionen och vänd försiktigt röret upp och ner 10 gånger. Centrifugera vid 200 x g i 10 minuter vid 4 °C. Pelleten innehåller livskraftiga leverceller som är berikade för hepatocyter, medan supernatanten innehåller döda celler och skräp. Kassera supernatanten med en serologisk pipett, lämna cirka 1 ml, och återsuspendera pelleten genom en försiktig virvel. Tillsätt 20 ml kallpläteringsmedium till cellsuspensionen och centrifugera vid 50 x g i 5 minuter vid 4 °C för att tvätta bort gradientlösningen. Ta bort supernatanten, lämna cirka 1 ml ovanför pelleten och återsuspendera cellerna i 20 ml kallpläteringsmedium.OBS: Här kan cellpelleten komprimeras, så om det behövs, använd en 10 ml serologisk pipett för att försiktigt dissociera cellerna. Bestäm cellantalet och livskraften manuellt med hjälp av en cellräkningskammare och Trypan Blue.OBS: Hepatocytcellerna kommer snabbt att fällas ut i röret; För att återsuspendera dem, vänd försiktigt röret några gånger. Såd levercellerna i 200 μL/brunn av platåmedium vid 1200 celler/brunn i 96-brunnars ultralåga vidhäftningsplattor.OBS: Den optimala volymen media per brunn är 200 μL; Det är dock möjligt att sådda celler i 100 μL/brunn. Snurra plattorna vid 200 x g i 3 minuter för att samla cellerna i mitten av brunnarna. Inkubera (37 °C, 5 % CO2 ) cellerna och låt dem bilda sfäroider i 5 dagar (figur 1C) på ett naturligt sätt. På dag 5, ta försiktigt bort hälften av mediet i brunnen och byt ut det mot serumfritt underhållsmedium (tabell 1). Upprepa detta steg var 48:e timme fram till dag 10, då leversfäroiderna är redo att transplanteras.OBS: Bildandet av en kapselliknande struktur i odlade leversfäroider visar god aggregering och livskraft. 2. Transplantation av leversfäroider till ögats främre kammare (ACE) FörberedelseFör transplantation av leversfäroider till ACE, se till att ordna följande resurser (figur 2A): stereomikroskop, isoflurananestesienhet, induktionskammare, isofluran, värmedyna, specialtillverkad metallbottenplatta, mushuvudhållare och gasmask, pincett fäst vid den solida universalknuten, Hamilton 500 μL gängad kolvspruta, silikon-, polyeten- och pumpslang, specialtillverkad trubbig glaskanyl eller 24 G kateter, etanol 70 %, steril koksaltlösning, sterila 23 G nålar, ögonsalva (flytande paraffin och vaselin i förhållandet 1:1), engångsspruta 1 ml och cellsuspensionsform 35 mm. Rengör Hamilton-sprutan, slangen och kanylen genom att passera 70 % etanol och koksaltlösning. Fyll Hamilton-sprutan, slangen och glaskanylen med koksaltlösning och fäst Hamilton-sprutan på bänken i horisontellt läge med tejp (Figur 2A). Använd en specialtillverkad trubbig glaskanyl.Förläng en kapillär av borosilikatglas med hjälp av en tvåstegs mikropipettavdragare till en innerdiameter på >300 μm för att tillåta aspiration av sfäroiderna. Fasa och trubba spetsen med en mikroelektrodavfasning och utsätt kanylspetsen för en låga i några sekunder för att mjuka upp kanterna.OBS: Mikroelektrodavfasningen består av en roterande slipsten som manövreras manuellt; Därför är specifika inställningar inte tillämpliga. Alternativt kan du konstruera en kanyl med hjälp av plastdelen av en 24 G-kateter (figur 2B). Förbered anestesi-isofluranenheten och värm värmedynan till 37 °C. Täck spetsarna på pincetten som är fästa vid den solida universalknuten med en bit polyetenslang för att bilda en ögla, vilket hjälper till att stabilisera ögat. Överför leversfäroiderna från 96-hålsplattan till en 35 mm cellsuspensionsskål med underhållsmedia med hjälp av en pipett och en 200 μL spets. ProcedurBedöva musen i induktionskammaren med en dos på 2,5 % isofluran och 280 ml/min luft. När musen är medvetslös, sänk anestesin till 1,8 % isofluran och 280 ml/min luft, anslut anestesislangen till huvudhållaren och överför snabbt djuret till värmedynan, placera nosen inuti huvudhållaren. Immobilisera huvudet med skruvarna, skjut försiktigt ut ögat ur uttaget och fäst det med pincetten och placera en droppe koksaltlösning på båda ögonen för att förhindra uttorkning. Använd Hamilton-sprutan under stereoskopet för att aspirera och samla upp leversfäroiderna i kanylens spets och låta dem vila horisontellt på en ren yta.OBS: Aspirerande media tillsammans med leversfäroiderna hjälper till att förhindra att de fastnar på kanylväggarna. Punktera försiktigt hornhinnan med en 23 G nål och torka den sipprande kammarvattnet med en servett. Om det behövs, för att göra snittet bredare, skjut försiktigt nålen i sidled för att skära av hornhinnan.OBS: En steril nål för engångsbruk används för att utföra hornhinnepunktionen, så att hornhinnan inte desinficeras före snittet. Tillsätt koksaltdroppar i ögat för att undvika uttorkning. Ta kanylen som innehåller leversfäroiderna och håll den vertikalt så att sfäroiderna kan dras mot kanylens spets. För försiktigt in kanylen i hålet och använd Hamilton-sprutan med fasningen riktad mot pupillen för att långsamt driva ut leversfäroiderna i ACE (Figur 2C).OBS: Innan du tar bort kanylen rekommenderar vi att du väntar några sekunder på att vätsketrycket inuti och utanför ögat ska justera och undvika att sfäroiderna kommer ut ur ögat igen. Från utsidan av hornhinnan, placera leversfäroiderna runt pupillen och bort från snittet genom att försiktigt peta på hornhinnan med kanylspetsen (Figur 2C). Vänta ~5-10 minuter tills leversfäroiderna har lagt sig på iris innan du släpper ögat från pincetten. Applicera vaselin ögonsalva på det opererade ögat, vilket hjälper till att smörja och läka hornhinnan. Om så önskas, fortsätt att operera det andra ögat enligt samma metod. Innan musen väcks, administrera ett smärtstillande medel för att undvika postoperativt obehag, till exempel 0,1 mg/kg buprenorfin i steril koksaltlösning, administrerat subkutant.OBS: Endast en dos smärtstillande medel administrerades till mössen eftersom de återhämtade sig snabbt från denna lilla procedur och inte visade några tecken på smärta eller förändrat beteende. Eftersom denna procedur är mycket snabb (tar mindre än 10 minuter) och endast orsakar mindre obehag, kräver mössen ingen postoperativ vård, förutom den postoperativa smärtlindring som administreras innan djuret väcks. 3. In vivo-avbildning av transplanterade leversfäroider i ACE FörberedelseFörbered följande material och instrument för icke-invasiv in vivo-avbildning av leversfäroider inympade i ACE (figur 3A): upprätt konfokalmikroskop, vattendoppningsobjektiv med lång arbetssträcka, isoflurananestesienhet, induktionskammare, isofluran, värmedyna, specialtillverkad metallbottenplatta, mushuvudhållare och gasmask, pincett fäst vid den solida universalleden, konstgjord tårgel, ögonsalva (flytande paraffin och vaselin i förhållandet 1:1). Valfria material inkluderar injicerbara fluorescerande sonder, engångssprutor och 27 G nålar för intravenös injektion av svansen. ProcedurBedöva musen i induktionskammaren med en dos på 2,5 % isofluran och 280 ml/min luft. När musen är medvetslös, sänk anestesin till 1,8 % isofluran och 280 ml/min luft, anslut anestesislangen till huvudhållaren och överför snabbt djuret till värmedynan, placera nosen inuti huvudhållaren. Immobilisera huvudet i huvudhållaren med hjälp av skruvarna. Placera en droppe konstgjord tårgel på båda ögonen för att förhindra uttorkning. Vid denna tidpunkt injiceras fluorescerande sonder intravenöst genom svansvenen och avbildas omedelbart efter. Luta huvudet, skjut försiktigt ut ögat ur uttaget och fäst det med en pincett och på plats under objektivet. Applicera en generös mängd konstgjord tårgel för att fylla utrymmet mellan hornhinnan och objektivet och fokusera på leversfäroiderna genom okularet.OBS: Om möjligt, ta bort okularet på ett av okular för att få icke-förstorad syn och lättare lokalisera sfäroiderna på iris. För att få högupplöst avbildning trots djurets andningsrörelser, använd 25x objektiv och följande bildinställningar: format 512 x 512 pixlar, skanningshastighet på 600 Hz och en Z-stacktjocklek på 3 μm. Se detaljerade bildinställningar i tabell 2.OBS: Under hela avbildningen justeras anestesikoncentrationen från 1,6-2,2 ml/h isofluran för att uppnå en ytlig, kontrollerad andningsrytm och därmed minimera djurets rörelse. I slutet av avbildningssessionen, behandla de avbildade ögonen med vaselin ögonsalva innan du tar bort isofluran och väcker djuret.

Representative Results

Primära leverceller, anrikade för hepatocyter, isolerades från muslevern genom tvåstegs kollagenasperfusion, med hjälp av en peristaltisk pump för att cirkulera varma buffertar genom levern och dra nytta av organets kärl för att leverera dissociationsenzymer till alla celler (Figur 1A). För detta kanylerades den nedre hålvenen och portvenen klipptes av för att tillåta genomströmning av buffertar (Figur 1B). Först spolades en HBSS-baserad buffert genom levern för att rensa blodet. Om kanyleringen lyckas och det inte finns några blodproppar bleknar levern och blir gul inom några sekunder. För det andra cirkulerades en nedbrytningsbuffert som innehöll enzymblandningen Liberase genom levern för att dissociera vävnaden till en encellssuspension. Cellerna räknades manuellt och såddes in i 96-brunnars ULA-plattor (ultra-low-adherens), som gör det möjligt att självorganisera sig till sfäroider inom några dagar. På dag 5 bildas sfäroiderna och den tunna kapseln som gränsar till sfäroiderna indikerar framgångsrik aggregering (Figur 1C). Vi väntar till dag 10 med transplantation, då sfäroiderna är kompakta och har utvecklat starka cell-cell-kopplingar. Antalet sådda celler per brunn bestämde storleken på leversfäroiden, med 1000, 1200 och 1500 celler/brunnsavkastande sfäroider på 238 μm ± 10 μm, 248 μm ± 17 μm respektive 298 μm ± 19 μm (medelvärde ± SD) diametrar (Figur 1C,D). För transplantation väljer vi sfäroider med en diameter på cirka 250 μm av följande skäl: (1) sfäroidernas storlek bör inte vara för stor för att undvika hypoxi och nekrotisk kärna, men bör innehålla tillräckligt med celler för att stödja cell-cellkommunikation och för att möjliggöra transplantatombyggnad i ögat, (2) vikten av sfäroider av denna storlek gör att de kan dras mot iris och förbättra deras ingrepp, (3) Denna storlek är lämplig i förhållande till transplantation av 5-10 sfäroider per musöga. Transplantationsoperationen kräver en manuellt gängad spruta som är ansluten till en glaskanyl (Figur 2A). Glaskanylen består av en kapillär av borosilikatglas som modifierats internt för att ha en fin trubbig spets med hjälp av en mikropipettavdragare och avfasning. En enklare alternativ kanyl kan skapas med hjälp av en kommersiellt tillgänglig plastkateter som är ansluten till sprutslangen och stabiliseras i en pipettspets (Figur 2B). Operationen består av inokulering av leversfäroider i ACE genom ett snitt i hornhinnan (Figur 2C). Sfäroiderna placerades vid pupillens kanter för att göra dem bättre tillgängliga för avbildning och undvika att de rör sig in i den okulära vinkeln. Albinomöss användes för transplantation, eftersom deras icke-pigmenterade iris gör det möjligt att avbilda de transplanterade leversfäroiderna in vivo . Mottagarmöss transplanterades i båda ögonen med 7-10 sfäroider/öga, och stereoskopiska bilder togs 3 dagar efter transplantation (post-Tx) samt 1 vecka och 1 månad efter Tx för att dokumentera hornhinnans läkning och sfäroidens ingreppsframgång (Figur 2D). Det är värt att notera att förändringen i utseendet på leversfäroiderna i ACE mellan när de är nytransplanterade och fullt transplanterade beror på att transplantatet sätter sig på iris, liksom på tillväxten av ett monolager av irisceller över sfäroiden. Andelen lyckade leversfäroider i levern i ACE är 70 % (n = 9 ögon hos både han- och honmöss) (Figur 2E). De första dagarna efter Tx är de mest kritiska för överlevnad och engraftment, troligen på grund av att det mottagande djuret gnuggar sig i ögonen och lossnar sfäroiderna innan hornhinnan har läkt. Storleken på leversfäroiderna skiljer sig inte nämnvärt efter Tx och förändringar i form tillskrivs transplantatets ombyggnad och engraftment (Figur 2F). 1 månad efter Tx var alla transplanterade sfäroider som fanns på iris vaskulariserade och innerverade, vilket visades genom immunofluorescensfärgning (Figur 2G). Icke-invasiv in vivo-avbildning utförs på sövda mottagarmöss med hjälp av ett upprätt konfokalmikroskop och långdistansdoppningsobjektiv (figur 3A, tabell 2). Fluorescensavbildningen i ACE kan uppnås genom olika tillvägagångssätt, som visas i figur 3B. Injektionen av fluorescerande sonder i cirkulationen i mottagarmusen gör det möjligt att visualisera olika celltyper och strukturer inom sfäroiderna. Vi använde lektin för att markera blodkärl (Figur 3C), CMFDA för att observera gallkanaliculinätverket (Figur 3D) och pHrodo-LDL, vilket bekräftade aktivt LDL-upptag i sfäroidceller (Figur 3E). Leversfäroider som genereras från reportermusmodeller kan också användas. Albumin-Cre:tdTomatsfäroider möjliggjorde märkning och spårning av hepatocyter (Figur 3F), och sfäroider som uttrycker biosensorn Fluorescent Ubiquitin Cell Cycle Indicator (FUCCI) användes för att visualisera cellcykeldynamiken vid encellsupplösning (Figur 3G). Slutligen kan leversfäroider modifieras genetiskt in vitro före transplantation, och i fallet med adeno-associerat virus (AAV)-GFP-transduktion observerades uttrycket in vivo i över 6 månader (Figur 3H). Figur 1: Isolering av primära hepatocyter hos möss och generering av leversfäroider. A) Material och utrustning som används för isolering av primära hepatocyter hos möss: 1. Buffertar för isolering. 2. Vattenbad; 3. Peristaltisk pump; 4. Petri rätt; 5. Cell sil; 6. Absorberande dyna; 7. Dissektionsmatta; 8. Celllyftare; 9. Fjärilsnål 27 G; 10. Verktyg för dissektion. B) Bukhålan under operationen: hålvenen kanyleras och perfunderas, och portvenen klipps av för att tillåta genomströmning av buffertarna. (C) Ljusfältsbilder av bildandet av leversfäroider in vitro vid 0 (d0), 5 (d5) och 10 (d10) dagar efter sådd, skalstreck = 200 μm. (D) Leversfäroidstorlek vid olika cellsåddkoncentrationer, n = 21 sfäroider. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 2: Transplantation och ingrepp av leversfäroider i ACE hos möss. A) Material och utrustning som används för transplantation (Tx) av leversfäroider till ACE: 1. Leversfäroider i odlingsskål; 2. Steril koksaltlösning; 3. Ögonsalva; 4. nålar 23 g; 5. Kanyl; 6. Hamilton spruta; 7. Anestesigastub; 8. Huvudhållare och gasmask; 9. Värmedyna; 10. Specialtillverkad bottenplatta i metall; 11. Pincett och solid kardanknut. (B) Inställning av kanyl och Hamilton-spruta: 1. Glaskanyl ansluten till Hamilton-sprutan via Portex-slang och en 27G-nål; 2. Glaskanylen är ansluten till Portex-slangen via ytterligare segment av silikonslang och PharMed-slang; 3. Alternativ monterad plastkanyl; 4. Delar som bildar plastkanylen: 24G BD Insyte plastkateter ansluten via PharMed-slang och mantlad i en avskuren 10 μl pipettspets för stabilitet och grepp. (C) Illustration av Tx-kirurgiska steg: 1. Sfäroiderna samlas in i kanylen; 2. Hornhinnan punkteras med en nål; 3. Kanylen sätts in i snittet och sfäroiderna släpps ut i ACE; 4. Från utsidan av ögat är sfäroiderna placerade nära pupillen och bort från snittet. (D) Stereoskopiska bilder av leversfäroider (sph) i musögat på operationsdagen och 3-, 7- och 30-dagar efter Tx. Pilar indikerar livskraftiga sfäroider. (E) Leversfäroid (storlek 1200 celler/brunn) engraftmenthastighet efter Tx, n= 9 ögon hos 6 mottagarmöss. F) Storleken på leversfäroider i odling, före transplantation (in vitro , n = 20 sfäroider från ett enda preparat) och 1 månad efter Tx i ACE (in vivo, n = 16 sfäroider hos 3 mottagarmöss), beräknad som medelvärdesberäkning av vertikala och horisontella diametrar. (G) Immunofluorescensfärgning av transplanterade leversfäroider 2 månader efter Tx, som visar vaskularisering (CD31, rosa, streckad linje avgränsar sfäroidmassan) och sympatisk innervation (tyrosinhydroxylas (TH), orange), skalstapel = 100 μm. Data för panel F har anpassats med tillstånd från Lazzeri-Barcelo et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur. Figur 3: Icke-invasiv intraokulär in vivo-avbildning av transplanterade leversfäroider. A) Material och utrustning som används för in vivo ACE-avbildning: 1. Upprätt konfokalmikroskop med laserskanning. 2. Mörk låda; 3. Motoriserad XYZ-steg; 4. Doppande mål; 5. Huvudhållare och gasmask; 6. Pincett och solid kardanknut; 7. Värmedyna; 8. Specialtillverkad bottenplatta i metall. (B) Diagram som visar olika metoder som används för in vivo-avbildning av fluorescerande avläsningar i leversfäroider transplanterade i ögat. (C-H) Representativa bilder av ACE-leversfäroider under in vivo avbildning med konfokalmikroskopi. Backscatter-signalen används för att observera sfäroidens volym och struktur; C) Blodkärl märkta genom intravenös injektion av fluorescerande lektin, skalstreck = 100 μm. D) Nätverk av gallkanaler märkta genom injektion av fluorescerande CMFDA, skalstapel = 50 μm. E) LDL-upptag genom injektion av fluorescerande pHrodo-LDL-sond, skalstreck = 100 μm. F) Td-tomatuttryckande hepatocyter, pilspetsar anger kärnor och asterisker anger intrasfäroid vaskulatur, skalstreck = 50 μm. (G) Övervakning av cellcykeldynamik i FUCCI-uttryckande leversfäroider, skalstänger = 50 μm (huvudbild) och 20 μm (uppblåsning). H) Leversfäroider som transducerats in vitro med AAV8-GFP före Tx och avbildats i ögat 6 månader efter Tx, skalstapel = 50 μm. Bilden i panel G har anpassats med tillstånd från Lazzeri-Barcelo et al.10. Klicka här för att se en större version av denna figur. Tabell 1: Lösningar som används för isolering av primära hepatocyter hos möss. Sammansättning av lösningar och buffertar som behövs för isolering av hepatocyter hos möss. Komponenterna i rötningsbufferten och gradientlösningen ska blandas färska på isoleringsdagen. Klicka här för att ladda ner denna tabell. Tabell 2. Konfokala Leica SP5-mikroskopinställningar som används för intraokulär in vivo-avbildning av leversfäroider. Tabellen har anpassats med tillstånd från Lazzeri et al.10. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Discussion

Detta protokoll beskriver en ny plattform för intraokulär in vivo-avbildning av leversfäroider inympade i ACE. ACE har tidigare använts som en transplantationsplats för andra organ-härledda mikrovävnader, såsom bukspottkörtelns ^{öar 11,12}, på grund av dess unika engraftmentmikromiljö, som är rik på kärl, nerver och syre, och tillgången till avbildning genom hornhinnan. Medan intravital leveravbildning möjliggör visualisering av celler och processer in situ, är longitudinell övervakning inte möjlig. Leveravbildning genom ett bukfönster innebär komplex kirurgi, och organets rörelse i kroppen gör det svårt att spåra enskilda celler över tid. Följaktligen möjliggör denna nya avbildningsmetod icke-invasiv, longitudinell övervakning av leverceller med encellsupplösning.

Detta protokoll är uppdelat i tre delar. Den första är isoleringen av primära hepatocyter via tvåstegs kollagenasperfusion, anpassad från Charni-Natan et ^al.13, med skillnaden att vi utför leverperfusionen på den döda musen istället för de sövda levande djuren. Denna variation ger vissa fördelar, såsom färre etiska överväganden och undvikande av anestesirester i organismen. I detta arbete genererar vi leversfäroider från den hepatocytberikade fraktionen av isoleringen, men detta utesluter inte potentialen att isolera andra icke-parenkymala cellpopulationer med hjälp av andra specialiserade protokoll för att göra samkultursfäroider med olika sammansättning^14,15.

Den andra delen av detta protokoll innebär transplantation av leversfäroiderna till ACE hos mottagarmöss. Detta är en snabb (under 10 min) och enkel operation som utförs på sövda möss och som inte kräver någon postoperativ behandling. Hornhinnan punkterar sig själv och läker under 3-5 dagar. Ibland, under läkningsprocessen, observeras en viss disning runt snittet, men detta försvinner inom några dagar. Vi har inte upplevt några fall av främre synechia hos opererade djur. Vi utför transplantationsprocedurerna i ett rent men öppet laboratorium och utan problem med infektioner i de opererade ögonen. Inokulering och ingrepp av sfäroider i ögat äventyrar inte synen eller förändrar beteendet hos mottagardjuret. I detta protokoll använder vi isoflurananenestesi för både transplantationskirurgi och in vivo-avbildning , vilket tolereras väl i möss. På grund av dess dosberoende effekt kan den enkelt justeras under hela proceduren och ger fördelen att minska sömn- och uppvakningstiderna. Alternativa injicerbara bedövningsmedel kan dock användas. Efter transplantation tillåter vi i allmänhet 1 månad för sfäroiderna att helt transplantera, bli vaskulariserade och innerverade, innan behandlingsinterventioner och in vivo-avbildning utförs. Vi har också visat att transplantation och engraftment är möjligt med hjälp av humana leversfäroider och immunsupprimerade mottagarmöss¹⁰.

Den tredje delen av denna metod är in vivo-avbildning av de transplanterade leversfäroiderna i ACE. Detta protokoll beskriver in vivo-avbildningsuppställningen, som använder mikroskopiutrustning som vanligtvis finns i forskningsanläggningar. Dessutom är de specialiserade materialen, som hållaren för mushuvudet och plastkanylen, nu kommersiellt tillgängliga. Med denna bildbehandlingsuppställning kan vi fånga z-sektioner och få en tredimensionell rekonstruktion av sfäroidarkitekturen, beroende på djupet av laserpenetration och fluorescensdetektering. Övervakning av cellulär funktion i de transplanterade leversfäroiderna bygger på visualisering av fluorescerande proteiner som rapporterar om celltyper, cellulära funktioner och dynamik. Således kan denna avbildningsplattform utnyttjas med hjälp av olika modaliteter, ensamma eller i kombination: (1) Fluorescerande sonder kan administreras intravenöst, t.ex. antikroppar för att märka och spåra celler samt funktionella färgämnen; (2) Leversfäroider kan genereras från celler isolerade från reportermusmodeller som uttrycker leverspecifika fluorescerande proteiner, t.ex. FUCCI-leversfäroider som rapporterar om cellcykelns dynamik; (3) Bildandet av leversfäroider in vitro kan kombineras med transfektion eller transduktion för att utrusta sfäroiderna med fluorescerande proteiner och biosensorer. t.ex. adenoassocierade virus. I våra experimentella miljöer och genom att använda en enda foton för excitation är det avbildningsdjup som är möjligt att uppnå ungefär 60-100 μm. Detta är dock beroende av laserns effekt och multifotonavbildningens tillgänglighet, fluorescenssondens emissionsegenskaper och känsligheten hos detektorerna, samt vinkeln på ögat som sfäroiden är inympad i. Efter bildinsamling kan bildanalysen nedströms utföras med hjälp av populära program som Image J och Imaris. Till exempel, i fallet med FUCCI-rapportören, kan cellcykelaktiva celler i grönt räknas och kontrasteras mot antalet totala röda blodkroppar för att bedöma cellcykelaktiviteten inom den transplanterade sfäroiden. Dessutom gör ACE-avbildningsplattformen det möjligt att applicera ämnen på ögat (i form av ögondroppar) eller injiceras direkt i ACE för att behandla transplantatet och övervaka dess reaktion. Efter döden kan de transplanterade sfäroiderna enkelt återfinnas genom manuell mikrodissektion och kan ge värdefull information genom ex vivo-tekniker, såsom immunofluorescensfärgning, transkriptomisk analys, ^etc.10.

Denna teknik har vissa begränsningar. Den första är att enligt vår erfarenhet måste mottagarmössen vara albino, dvs ha icke-pigmenterad iris. Vid engraftment blir leversfäroiderna täckta av ett monolager av irisceller, vilket inte påverkar sfäroidernas livskraft eller funktion, men pigmentet i iriscellerna förhindrar avbildning. En andra faktor är stabiliteten under intraokulär avbildning hos sövda möss. Under in vivo-avbildningssessionerna måste anestesikoncentrationen och andningen hos djuret övervakas noggrant för att minimera rörelse. Med hjälp av de bildinställningar som anges här kan vi dock uppnå högupplöst avbildning på encellsnivå.

För att sammanfatta beskriver detta protokoll implementeringen av en icke-invasiv in vivo-avbildningsplattform av leverliknande vävnad inympad i ögonen på möss. Vi använder enkla procedurer, vanlig utrustning och prisvärda material, vilket gör det till ett uppnåeligt tillvägagångssätt för många utredare. Denna modell kombinerar fördelarna med in vitro 3D-leversfäroider med in vivo-miljön och den optiska tillgängligheten som tillhandahålls av ACE för att skapa en värdefull plattform för att studera leverfysiologi och patologi i grundforskning och prekliniska miljöer.

Materials

27 G butterfly needle	Venofix	4056388
AAV8-CAG-GFP	Charles River	CV17169-AV9	Incubated with isolated hepatocytes at 1 µL/mL during liver spheroid formation
Absolute and 70% ethanol	N/A	N/A
Absorbent pad	Attends	203903
Albumin-Cre;RCL-tdTomato (B6.Cg-Speer6-ps1Tg(Alb-cre)21Mgn/J ; B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J)	Jackson	#003574 and #007914	Mice obtained from in-house breeding
B6 albino mice (B6(Cg)-Tyrc-2J/J)	Jackson	#000058	Mice obtained from in-house breeding
B6;129P2-Gt(ROSA)26Sor[tm1(CAG-Venus/GMNN,-Cherry/CDT1)Jkn]/JknH	INFRAFRONTIER/EMMA	EM:08395	Mice obtained from in-house breeding
BD Insyte IV Catheter 24 G x 0.75 in	BD Medical	381212
Borosillicate standard glass cappilaries	World Precision Instruments	1B150-4
Cell lifter	Corning	3008
Cell strainer, 70 µm	Falcon	352350
Custom-made metal plate	Hardware store	N/A
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902
Dual-Stage Glass Micropipette Puller	Narshige	Model PC-100
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Electric heating pad	Hardware store	N/A
FBS	Gibco	N/A
GlutaMAX	Gibco	35050061
Green CMFDA	Abcam	ab145459	Reconstituted in DMSO, administered at 100 µg/mouse in PBS 10% FBS
Hamilton syringe	Hamilton	81242	Model 1750 Luer Tip Threaded Plunger Syringe, 500 µL
HBSS; no calcium, no magnesium and no phenol red	Gibco	14175095
HCX IRAPO L 25x/0.95 W objective	Leica	N/A
HEPES	Gibco	15630080
Induction chamber 0.8 L	Univentor	8329001
Insulin-Transferrin-Selenium (ITS-G)	Gibco	41400045
Isoflurane	Baxter	N/A
Lectin DyLight-649	Invitrogen	L32472	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Liberase TM Research Grade	Sigma-Aldrich	5401127001
Microelectrode beveler	World Precision Instruments	Model BV-10
Mouse head-holder and gas mask	Narshige	Model SGM-4
Nunclon Sphera 96-Well, U-Shaped-Bottom Microplate	Thermo Fisher	174929
Oculentum simplex	APL	N/A
PBS 10x	Gibco	14080055
PBS 1x; no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644
Peristaltic pump	Ismatec	Model ISM795
PharMed BPT Pump Tubing	VWR	VERN070540-07	Inner diameter 0.76 mm, outer diameter 2.46 mm
pHrodo Red-LDL	Invitrogen	L34356	Administered at 1 mg/mL and 100 µL/mouse
Portex Fine Bore Polyethylene Tubing	Smiths Medical	800/100/140	Inner diameter 0.4 mm, outer diameter 0.8 mm
Silicone dissection mat	Hardware store	N/A
Sodium chloride 0.9%	Braun	N/A
Solid Universal Joint	Narshige	Model UST-2
Stereomicroscope	Leica	Model M80
Suspension culture dish 35 mm	Sarstedt	833900500
Temgesic	Indivor	N/A	Administered s.c. at 0.05 mg/mL and 2 µL/g mouse
Translucent Silicone Tubing	VWR	228-1450	Inner diameter 1.5 mm, outer diameter 3 mm
Trypan Blue	Sigma-Aldrich	T8154
Univentor 400 Anesthesia unit	Univentor	8323001
Upright laser scanning confocal microscope	Leica	Model TCS SP5 II
Viscotears	Novartis	N/A
William's E Medium; no glutamine, phenol red	Gibco	22551089