Måling af bakteriel kolonisering på Arabidopsis thaliana rødder i hydroponisk tilstand
Summary
Kolonisering af plantevækstfremmende rhizobakterier (PGPR) i rhizosfæren er afgørende for dens vækstfremmende virkning. Det er nødvendigt at standardisere metoden til påvisning af bakteriel rhizosfærekolonisering. Her beskriver vi en reproducerbar metode til kvantificering af bakteriekolonisering på rodoverfladen.
Abstract
Måling af bakteriekolonisering på Arabidopsis thaliana rod er et af de hyppigste forsøg i plante-mikrobe interaktionsundersøgelser. En standardiseret metode til måling af bakteriekolonisering i rhizosfæren er nødvendig for at forbedre reproducerbarheden. Vi dyrkede først steril A. thaliana under hydroponiske forhold og podede derefter bakteriecellerne i rhizosfæren ved en endelig koncentration på OD600 på 0,01. 2 dage efter podning blev rodvævet høstet og vasket tre gange i sterilt vand for at fjerne de ukoloniserede bakterieceller. Rødderne blev derefter vejet, og bakteriecellerne koloniseret på roden blev opsamlet af hvirvel. Cellesuspensionen blev fortyndet i en gradient med en fosfatbufret saltvandsbuffer (PBS) efterfulgt af plettering på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Pladerne blev inkuberet ved 37 °C i 10 timer, og derefter blev de enkelte kolonier på LB-plader talt og normaliseret for at indikere bakteriecellerne koloniseret på rødder. Denne metode anvendes til at detektere bakteriekolonisering i rhizosfæren under monointeraktionsbetingelser med god reproducerbarhed.
Introduction
Der er kvantitative og kvalitative metoder til påvisning af rhizosfærekolonisering af en enkelt bakteriestamme. Til den kvalitative metode bør der anvendes en stamme, der konstitutivt udtrykker fluorescens, og fluorescensfordelingen og -intensiteten bør undersøges ved fluorescensmikroskopi eller laserkonfokale instrumenter 1,2. Disse strategier kan godt afspejle bakteriel kolonisering in situ3, men de er ikke så nøjagtige som traditionelle pladetællingsmetoder til kvantificering. På grund af begrænsningen ved kun at vise delvise rodzoner under mikroskopet kan det undertiden påvirkes af subjektiv bias.
Her beskriver vi en kvantitativ metode, som omfatter indsamling af de koloniserede bakterieceller og tælling af de bakterielle CFU’er på en plade. Denne metode er baseret på fortynding og plettering, hvorved de koloniserede stammer, der blev fjernet fra planterødder, kan tælles, og det samlede koloniserede bakterieantal på roden kan beregnes 4,5.
For det første blev A. thaliana dyrket under hydroponiske forhold, og derefter blev bakterieceller inokuleret i rhizosfæren i en endelig koncentration på 0, 01 OD600. De inficerede rodvæv blev høstet 2 dage efter podning og vasket i sterilt vand for at fjerne de ukoloniserede bakterieceller. Endvidere blev bakterieceller koloniseret på roden opsamlet, fortyndet i fosfatbufret saltvand (PBS) buffer og belagt på et Luria-Bertani (LB) agarmedium. Efter inkubation ved 37 °C i 10 timer blev enkelte kolonier på LB-plader talt og normaliseret for at bestemme bakteriecellerne koloniseret på rødder.
Denne metode er meget anvendelig, har god repeterbarhed og er mere egnet til nøjagtig bestemmelse af rhizosfærens bakterielle kolonisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at opnå god reproducerbarhed er der fire kritiske trin til koloniseringsdetekteringsprocessen for denne protokol. For det første er det nødvendigt at sikre, at antallet af podede bakterieceller er nøjagtigt det samme i hvert forsøg. For det andet er det også nødvendigt at kontrollere den ukoloniserede bakterierensningsintensitet med sterilt vand. For det tredje skal hver prøvefortyndingsproces hvirvelbehandles, før den udføres, for at lade prøven være i en fuldstændig blandingstilstand for at undgå abso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (32370135), innovationsprogrammet fra det kinesiske akademi for landbrugsvidenskab (CAAS-CSAL-202302), videnskabs- og teknologiprojektet fra Jiangsu Vocational College of Agriculture and Forestry (2021kj29).
Materials
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| Filter cell stainer | Solarbio | F8200-40µm | |
| Microplate reader | Tecan | Infinite M200 PRO | |
| Murashige and Skoog medium | Hopebio | HB8469-5 | |
| NaClO | Alfa | L14709 | |
| Phytagel | Sigma-Aldrich | P8169 | |
| Square petri dish | Ruiai Zhengte | PYM-130 | |
| Vortex Genie2 | Scientific Industries | G560E |
References
- Wang, B., Wan, C., Zeng, H. Colonization on cotton plants with a GFP labeled strain of Bacillus axarquiensis. Curr Microbiol. 77 (10), 3085-3094 (2020).
- Zhai, Z., et al. A genetic tool for production of GFP-expressing Rhodopseudomonaspalustris for visualization of bacterial colonization. AMB Express. 9 (1), 141 (2019).
- Synek, L., Rawat, A., L’Haridon, F., Weisskopf, L., Saad, M. M., Hirt, H. Multiple strategies of plant colonization by beneficial endophytic Enterobacter sp. SA187. Environ Microbiol. 23 (10), 6223-6240 (2021).
- Zhang, H., et al. Bacillus velezensis tolerance to the induced oxidative stress in root colonization contributed by the two-component regulatory system sensor ResE. Plant Cell Environ. 44 (9), 3094-3102 (2021).
- Liu, Y., et al. Plant commensal type VII secretion system causes iron leakage from roots to promote colonization. Nat Microbiol. 8 (8), 1434-1449 (2023).
- Feng, H., et al. Identification of chemotaxis compounds in root exudates and their sensing chemoreceptors in plant-growth-promoting Rhizobacteria Bacillus amyloliquefaciens SQR9. Mol Plant Microbe Interact. 31, 995-1005 (2018).
- Woo, S. L., Hermosa, R., Lorito, M., Monte, E. Trichoderma: a multipurpose, plant-beneficial microorganism for eco-sustainable agriculture. Nat Rev Microbiol. 21 (5), 312-326 (2023).
- Nongkhlaw, F. M., Joshi, S. R. Microscopic study on colonization and antimicrobial property of endophytic bacteria associated with ethnomedicinal plants of Meghalaya. J Microsc Ultrastruct. 5 (3), 132-139 (2017).
- Ravelo-Ortega, G., Raya-González, J., López-Bucio, J. Compounds from rhizosphere microbes that promote plant growth. Curr Opin Plant Biol. 73, 1369-5266 (2023).
- Schulz-Bohm, K., Gerards, S., Hundscheid, M., Melenhorst, J., de Boer, W., Garbeva, P. Calling from distance: attraction of soil bacteria by plant root volatiles. ISME J. 12 (5), 1252-1262 (2018).
- Sharifi, R., Lee, S. M., Ryu, C. M. Microbe-induced plant volatiles. New Phytol. 220 (3), 684-691 (2018).
- Eckshtain-Levi, N., Harris, S. L., Roscios, R. Q., Shank, E. A. Bacterial community members increase Bacillus subtilis maintenance on the roots of Arabidopsis thaliana. Phytobiomes J. 4, 303-313 (2020).
- Liu, Y., et al. Root colonization by beneficial rhizobacteria. FEMS Microbiol Rev. 48, (2024).
- Yahya, M., et al. Differential root exudation and architecture for improved growth of wheat mediated by phosphate solubilizing bacteria. Front Microbiol. 12, 744094 (2021).
- Husna, K. B. -. E., Won, M. -. H., Jeong, M. -. I., Oh, K. -. K., Park, D. S. Characterization and genomic insight of surfactin-producing Bacillus velezensis and its biocontrol potential against pathogenic contamination in lettuce hydroponics. Environ Sci Pollut Res Int. 30 (58), 121487-121500 (2023).
