Sanntids polymerasekjedereaksjonsbasert deteksjon og kvantifisering av hepatitt B-virus DNA

Summary

Sanntids polymerasekjedereaksjon (PCR)-basert påvisning og kvantifisering av hepatitt B-virus (HBV) DNA er en sensitiv og nøyaktig metode for diagnostisering og overvåking av HBV-infeksjon. Her presenterer vi en protokoll for HBV DNA-deteksjon og virusbelastningsmåling av en prøve.

Abstract

Hepatitt B-virus (HBV) er en betydelig årsak til leversykdom over hele verden. Det kan føre til akutte eller kroniske infeksjoner, noe som gjør individer svært utsatt for dødelig skrumplever og leverkreft. Nøyaktig påvisning og kvantifisering av HBV DNA i blodet er avgjørende for diagnostisering og overvåking av HBV-infeksjon. Den vanligste metoden for å oppdage HBV DNA er sanntids PCR, som kan brukes til å oppdage viruset og vurdere virusbelastningen for å overvåke responsen på antiviral terapi. Her beskriver vi en detaljert protokoll for påvisning og kvantifisering av HBV DNA i humant serum eller plasma ved bruk av et IVD-merket sanntids PCR-basert sett. Settet bruker primere og prober som retter seg mot den svært konserverte kjerneregionen i HBV-genomet og kan nøyaktig kvantifisere alle HBV-genotyper (A, B, C, D, E, F, G, H, I og J). Settet inneholder også en endogen internkontroll for å overvåke mulig PCR-hemming. Denne analysen går i 40 sykluser, og avskjæringen er 38 Ct. For kvantifisering av HBV DNA i kliniske prøver, følger et sett med 5 kvantifiseringsstandarder med settet. Standardene inneholder kjente konsentrasjoner av HBV-spesifikt DNA som er kalibrert mot 4^. WHOs internasjonale standard for HBV DNA for nukleinsyretesten (NIBSC-kode 10/266). Standardene brukes til å validere funksjonaliteten til den HBV-spesifikke DNA-amplifiseringen og for å generere en standardkurve som tillater kvantifisering av HBV-DNA i en prøve. HBV DNA så lavt som 2,5 IE / ml ble detektert ved hjelp av PCR-settet. Den høye følsomheten og reproduserbarheten til settet gjør det til et kraftig verktøy i kliniske laboratorier, og hjelper helsepersonell med å effektivt diagnostisere og håndtere HBV-infeksjoner.

Introduction

Hepatitt B-virus (HBV) er et delvis dobbeltstrenget DNA-virus fra slektene Orthohepadnavirus og Hepadnaviridae-familien ¹. Det kan utløse en kronisk infeksjon som vedvarer gjennom hele livet, som potensielt fører til levercirrhose og hepatocellulært karsinom ^2,3,4. Ifølge Verdens helseorganisasjon (WHO) levde en estimert befolkning på 296 millioner mennesker med kronisk hepatitt B-infeksjon i 2019, og 1,5 millioner mennesker ble nylig smittet hvert år⁵.

Identifisering og måling av HBV DNA i serum- eller plasmaprøver tjener som en verdifull metode for å oppdage personer med en pågående hepatitt B-infeksjon, vurdere effekten av antiviral behandling og forutsi sannsynligheten for behandlingssuksess 6,7,8,9,10,11. Høy viral belastning er forbundet med økt risiko for progresjon av leversykdom, inkludert skrumplever og leverkreft ^12,13. Derfor er presis måling av virusbelastning avgjørende for å spore utviklingen av HBV-infeksjon og informere beslutninger om behandling.

Kvantitative sanntids PCR-analyser har høyere sensitivitet, bredere dynamisk område og mer nøyaktig kvantifisering av HBV DNA enn konvensjonelle PCR-teknikker 14,15,16,17. Flere kommersielle sanntids PCR-baserte molekylære diagnostiske sett for kvantifisering av HBV DNA i serum eller plasmaprøver er tilgjengelige i markedet. Her beskriver vi en detaljert arbeidsflyt for påvisning og kvantifisering av HBV DNA i humant serum eller plasma ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig, IVD-merket sanntids PCR-basert sett. Settet er en mye brukt^18,19, rimelig, men svært følsom analyse, og ytelsesegenskapene er sammenlignbare med andre kommersielt tilgjengelige CE-merkede sett(er)¹⁸. Bortsett fra HBV-målområdeamplifikasjonen, er et endogent internkontrollgen også inkludert i settet for å verifisere kvaliteten på prøver, kvaliteten på ekstrahert DNA, PCR-amplifikasjon og mulig PCR-hemming.

Protocol

Denne studien involverte ingen menneskelige deltakere eller kliniske prøver. Det eneste biologiske materialet som ble brukt var den 4. WHO internasjonale standarden for HBV DNA for nukleinsyretest (NIBSC-kode 10/266). Denne standarden er et offentlig tilgjengelig referansemateriale som ikke inneholder personlig informasjon eller identifiserbare data. Som sådan var det ikke nødvendig med etisk godkjenning for denne studien. 1. DNA-ekstraksjon Ekstraher v…

Representative Results

Et skjematisk diagram over arbeidsflyten for å påvise og kvantifisere HBV DNA fra humant plasma/serum er vist i figur 1. Et forsterkningsplott av Standard 2 (brukt som PC) og NTC for både HBV og IC er vist i figur 2. Figur 3 viser amplifikasjonskurvene for en HBV-positiv prøve, en HBV-negativ prøve og en prøve med PCR-hemming. Forsterkningskurven, Ct-verdi for HBV og oppnådd HBV-konsentrasjon i internasjonale enheter per mikr…

Discussion

NIBSC-kode 10/266 har blitt tildelt en enhet på 9,55,000 IE/ml når den rekonstitueres i 0,5 ml nukleasefritt vann i henhold til leverandørinformasjonen²¹. Dette kan betraktes som en HBV-positiv prøve med høy belastning. HBV-virusmengden bestemt av virusbelastningssettet som ble brukt i denne studien, var 6,65,900 IE / ml (figur 4). Siden DNA-ekstraksjonseffektiviteten til et DNA-ekstraksjonssett ikke er 100%, går noe DNA ofte tapt under renseprosessen. Selv om v…

Materials

4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198