Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Shaileshanand Jha; Sucharita Bose; Kutti R. Vinothkumar

doi:10.3791/66310

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochimie

نمذجة الروابط في الخرائط المشتقة من المجهر الإلكتروني بالتبريد

Published: July 19, 2024

doi:

10.3791/66310

Shaileshanand Jha*¹, Sucharita Bose*², Kutti R. Vinothkumar

¹National Centre for Biological Sciences,Tata Institute of Fundamental Research, ²Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

Summary

يقدم هذا البروتوكول الأدوات المتاحة لنمذجة الروابط ذات الجزيئات الصغيرة في خرائط cryoEM للجزيئات الكبيرة.

Abstract

يعد فك رموز تفاعلات البروتين والليجند في مركب جزيئي كبير أمرا بالغ الأهمية لفهم الآلية الجزيئية والعمليات البيولوجية الأساسية وتطوير الأدوية. في السنوات الأخيرة ، ظهر المجهر الإلكتروني للعينة المبردة (cryoEM) كتقنية قوية لتحديد هياكل الجزيئات الكبيرة والتحقيق في طريقة ربط الربيطة بدقة شبه ذرية. غالبا ما يكون تحديد ونمذجة الجزيئات غير البروتينية في خرائط cryoEM أمرا صعبا بسبب الدقة متباينة الخواص عبر الجزيء محل الاهتمام والضوضاء المتأصلة في البيانات. في هذه المقالة ، يتم تعريف القراء على العديد من البرامج والأساليب المستخدمة حاليا لتحديد الليجند ، وبناء النماذج ، وتحسين الإحداثيات الذرية باستخدام جزيئات كبيرة مختارة. تتمثل إحدى أبسط الطرق لتحديد وجود الرباط، كما هو موضح بإنزيم الإنولاز، في طرح الخريطتين اللتين تم الحصول عليهما مع الربيطة وبدونها. من المرجح أن تبرز الكثافة الإضافية لليجند في خريطة الاختلاف حتى عند عتبة أعلى. هناك حالات ، كما هو موضح في حالة مستقبلات الغلوتامات الأيضية mGlu₅ ، عندما لا يمكن إنشاء خرائط الفرق البسيطة هذه. يمكن أن تكون الطريقة التي تم إدخالها مؤخرا لاشتقاق خريطة حذف Fo-Fc بمثابة أداة للتحقق من وجود الرباط وإثباته. أخيرا ، باستخدام β-galactosidase المدروس جيدا كمثال ، يتم تحليل تأثير الدقة على نمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في خرائط cryoEM ، ويتم تقديم نظرة عامة حول كيفية استخدام cryoEM في اكتشاف الأدوية.

Introduction

تنجز الخلايا وظائفها من خلال إجراء تفاعلات كيميائية لا حصر لها في وقت واحد وبشكل مستقل ، كل منها منظم بدقة لضمان بقائها وقدرتها على التكيف استجابة للإشارات البيئية. يتم تحقيق ذلك عن طريق التعرف الجزيئي ، والذي يمكن الجزيئات الحيوية ، وخاصة البروتينات ، من تكوين مجمعات عابرة أو مستقرة مع جزيئات كبيرة أخرى وكذلك جزيئات صغيرة أو روابط¹. وبالتالي ، فإن تفاعلات البروتين والليجند أساسية لجميع العمليات في علم الأحياء ، والتي تشمل تنظيم تعبير البروتين ونشاطه ، والتعرف على الركائز والعوامل المساعدة بواسطة الإنزيمات ، وكذلك كيفية إدراك الخلايا لإشارات ^1,2 وترحيلها. يكشف الفهم الأفضل للخصائص الحركية والديناميكية الحرارية والهيكلية لمركب البروتين والليجند عن الأساس الجزيئي لتفاعل الليجند ويسهل أيضا التصميم العقلاني للدواء من خلال تحسين التفاعل الدوائي والنوعية. يتمثل النهج الاقتصادي والأسرع لدراسة تفاعل البروتين والليجند في استخدام الالتحام الجزيئي ، وهي طريقة حسابية تفحص فعليا مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة وتتنبأ بوضع الارتباط وتقارب هذه الروابط لاستهداف^{البروتينات 3}. ومع ذلك ، فإن الأدلة التجريبية من الهياكل عالية الدقة التي يحددها حيود الأشعة السينية (XRD) أو الرنين المغناطيسي النووي (NMR) أو المجهر الإلكتروني بالتبريد (cryoEM) توفر الدليل الأساسي لمثل هذه التنبؤات وتساعد في تطوير منشطات أو مثبطات أحدث وأكثر فعالية لهدف معين. تستخدم هذه المقالة الاختصار “cryoEM” كما يشار إلى التقنية عادة. ومع ذلك ، هناك نقاش مستمر حول اختيار التسمية الصحيحة ، ومؤخرا ، تم اقتراح مصطلحcryo genic-sample Electron Microscopy (cryoEM) للإشارة إلى أن العينة في درجة حرارة مبردة ويتم تصويرها بالإلكترونات⁴. وبالمثل ، فإن الخرائط المشتقة من cryoEM تسمى جهد الإلكترون أو الجهد الكهروستاتيكي أو جهد كولوم ، وللتبسيط ، نستخدم هنا خرائط cryoEM⁵^،⁶^،⁷^،⁸^،⁹^،¹⁰.

على الرغم من أن XRD كانت التقنية القياسية الذهبية في تحديد البنية عالية الدقة لمجمعات البروتين ، إلا أن cryoEM بعد ثورة^{الدقة 11} اكتسبت زخما ، كما يتضح من زيادة خرائط Coulomb المحتملة أو خرائط cryoEM المودعة في قاعدة بيانات المجهر الإلكتروني (EMDB) ^12,13 على مدى السنوات القليلة^{الماضية 14}. نظرا للتقدم في إعداد العينات والتصوير وطرق معالجة البيانات ، زاد عدد ترسبات بنك بيانات البروتين (PDB) ¹⁴ التي تستخدم cryoEM من 0.7٪ إلى 17٪ بين عامي 2010 و 2020 ، مع تحديد ما يقرب من 50٪ من الهياكل المبلغ عنها في عام 2020 بدقة 3.5 Å أو أفضل^15,16. تم اعتماد CryoEM بسرعة من قبل مجتمع البيولوجيا الهيكلية ، بما في ذلك صناعة الأدوية ، لأنه يسمح بدراسة الجزيئات البيولوجية الكبيرة المرنة وغير البلورية ، وخاصة البروتينات الغشائية والمجمعات متعددة البروتينات ، بدقة شبه ذرية ، والتغلب على عملية التبلور والحصول على بلورات حيود جيدة المطلوبة لتحديد بنية عالية الدقة بواسطة XRD.

تعد النمذجة الدقيقة لليجند في خريطة cryoEM أمرا بالغ الأهمية ، لأنها بمثابة مخطط لمجمع البروتين والليجند على المستوى الجزيئي. هناك العديد من أدوات بناء الرباط الآلية المستخدمة في علم البلورات بالأشعة السينية والتي تعتمد على شكل وطوبولوجيا كثافة الربيطة من أجل ملاءمة أو بناء الربيطة في كثافة الإلكترون¹⁷^،¹⁸^،¹⁹^،²⁰. ومع ذلك ، إذا كانت الدقة أقل من 3 Å ، فإن هذه الأساليب تميل إلى إنتاج نتائج أقل استحسانا لأن السمات الطوبولوجية التي تعتمد عليها للاعتراف والبناء تصبح أقل تحديدا. في كثير من الحالات ، أثبتت هذه الطرق عدم فعاليتها في نمذجة الروابط بدقة في خرائط cryoEM ، حيث تم تحديد هذه الخرائط في نطاق الدقة المنخفضة إلى المتوسطة ، عادة بين 3.5 Å-5 Å¹⁷.

تتضمن الخطوة الأولى في تحديد بنية 3D لمركب البروتين والليجند بواسطة cryoEM إما التنقية المشتركة لليجند مع البروتين (عندما يكون لليجند تقارب ارتباط عالي بالبروتين) أو احتضان محلول البروتين مع الربيطة لمدة محددة قبل إعداد الشبكة. بعد ذلك ، يتم وضع حجم عينة صغير على شبكة TEM هولي تنظيفها بالبلازما ، يليها تجميد فلاش في الإيثان السائل والتصوير في النهاية باستخدام cryo-TEM. يتم حساب متوسط صور الإسقاط 2D من مئات الآلاف إلى الملايين من الجسيمات الفردية لإعادة بناء خريطة إمكانات كولوم ثلاثية الأبعاد (3D) للجزيء الكبير. يشكل تحديد ونمذجة الروابط وجزيئات المذيبات في هذه الخرائط تحديات كبيرة في كثير من الحالات بسبب دقة الخواص عبر الخريطة (أي أن الدقة ليست موحدة عبر الجزيء الكبير) ، والمرونة في المنطقة التي يرتبط فيها الربيطة ، والضوضاء في البيانات. يتم الآن تكييف العديد من أدوات النمذجة والتحسين والتصور التي تم تطويرها ل XRD للاستخدام في cryoEM لنفس الأغراض¹⁸^،¹⁹^،²⁰^،²¹. في هذه المقالة ، يتم تقديم نظرة عامة على الأساليب والبرامج المختلفة المستخدمة حاليا لتحديد الروابط وبناء النماذج وتحسين الإحداثيات المشتقة من cryoEM. تم توفير بروتوكول خطوة بخطوة لتوضيح العمليات التي تنطوي عليها نمذجة الروابط باستخدام معقدات بروتين ليجند محددة بدقة وتعقيد متفاوتين.

تتضمن الخطوة الأولى في نمذجة الروابط في خرائط cryoEM تحديد كثافة الربيطة (غير البروتينية) في الخريطة. إذا كان ارتباط الربيطة لا يحدث أي تغيير مطابق في البروتين ، فإن حساب خريطة فرق بسيطة بين مركب البروتين والليجند وبروتين apo يسلط الضوء بشكل أساسي على مناطق الكثافة الإضافية ، مما يشير إلى وجود الرباط. يمكن ملاحظة هذه الاختلافات على الفور ، لأنها تتطلب خريطتين فقط ، وحتى الخرائط الوسيطة أثناء عملية تحسين 3D يمكن استخدامها للتحقق مما إذا كان الرباط موجودا. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الدقة عالية بما يكفي (<3.0 Å) ، فيمكن أن توفر خريطة الفرق أيضا نظرة ثاقبة لموقع جزيئات الماء وكذلك الأيونات التي تتفاعل مع الرباط وبقايا البروتين.

في غياب خريطة apo-protein ، أصبح من الممكن الآن استخدام Servalcat²² ، والذي يتوفر كأداة قائمة بذاتها وتم دمجه أيضا في مجموعة برامج CCP-EM^23,24 كجزء من تحسين Refmac وفي إصدار CCP4 8.0^25,26. يسمح Servalcat بحساب خريطة الفرق المرجح FSC (Fo-Fc) باستخدام الخرائط النصفية غير الحادة ونموذج apoprotein كمدخلات. تمثل خريطة حذف Fo-Fc التباين بين الخريطة التجريبية (Fo) والخريطة المشتقة من النموذج (Fc). في حالة عدم وجود ليجند في النموذج ، فإن الكثافة الموجبة في خريطة Fo-Fc التي تتداخل مع خريطة EM التجريبية تشير عادة إلى وجود الرباط. الافتراض هنا هو أن سلسلة البروتين مثبتة جيدا في الخريطة ، وتشير الكثافة الموجبة المتبقية إلى موقع الرباط. ومع ذلك ، من المهم أن نفحص بدقة ما إذا كانت الكثافة الإيجابية تنبع من عدم دقة النمذجة ، مثل الدوار الخاطئ لسلسلة جانبية للبروتين.

تتضمن الخطوة الثانية الحصول على أو إنشاء ملف إحداثي ديكارتي لليجند بهندسة محددة جيدا من المعلومات الكيميائية المتاحة. يمكن استخدام الروابط القياسية (على سبيل المثال ، ATP و NADP ⁺) المتوفرة بالفعل في مكتبة مونومر CCP4 للتحسين عن طريق استرداد ملفات الإحداثيات والهندسة عبر رمز انضمام المونومر الخاص بها. ومع ذلك ، بالنسبة للروابط غير المعروفة أو غير القياسية ، تتوفر أدوات مختلفة لإنشاء ملفات الهندسة. تتضمن بعض الأمثلة eLBOW²⁷ – (منشئ الرباط الإلكتروني ومنضدة عمل التحسين) في Phenix²⁸ ، Lidia – أداة مدمجة في Coot²⁹ ، JLigand / ACEDRG^30,31 ، CCP-EM^23,24 ، Ligprep^32-وحدة من Glide داخل مجموعة Schrodinger. ثم يتم تركيب ملف إحداثيات الرباط في الكثافة ، مسترشدا بكل من خريطة cryoEM التجريبية وخريطة الفرق في Coot. ويتبع ذلك تحسين الفضاء الحقيقي في فينيكس²⁸ أو التحسين المتبادل في Refmac³³. مطلوب محطة عمل Linux أو كمبيوتر محمول مزود ببطاقة رسومات جيدة والبرامج المذكورة أعلاه. يتم تضمين معظم هذه البرامج في أجنحة مختلفة. CCP-EM²⁴و Phenix²⁸ متاحان مجانا للمستخدمين الأكاديميين ويتضمنان مجموعة متنوعة من الأدوات المستخدمة في هذه المقالة ، بما في ذلك Coot و Refmac5³³^،³⁴،³⁵^،³⁶ و Servalcat و phenix.real_space_refine وما إلى ذلك. وبالمثل ، توفر Chimera³⁷ و ChimeraX³⁸ تراخيص مجانية للمستخدمين الأكاديميين.

Protocol

1. نمذجة فوسفوينول بيروفات (PEP) في enolase من المتفطرة السلية تحديد كثافة الربيطة في خريطة cryoEM لمركب PEP-enolaseقم بتنزيل أنصاف الخرائط غير الواضحة (emd_30988_additional_1.map و emd_30988_additional_2.map) ل apo-enolase من البيانات الإضافية في EMDB (انظر جدول المواد). افتح ChimeraX (انظر جدول ا…

Representative Results

المثال 1يحفز إنزيم enolase من M. tuberculosis الخطوة قبل الأخيرة من تحلل السكر ويحول 2-phosphoglycerate إلى فسفوينول بيروفات (PEP) ، وهو وسيط أساسي للعديد من المسارات الأيضية44,45. تم جمع بيانات CryoEM لعينات enolase المرتبطة ب apo-enolase و PEP بنفس حجم البكسل البالغ 1.07 Å ، وتم ?…

Discussion

أدت التحسينات في أجهزة وبرامج المجهر إلى زيادة عدد هياكل cryoEM في السنوات الأخيرة. على الرغم من أن أعلى دقة تم تحقيقها في الوقت الحالي في cryoEM أحادي الجسيم هي 1.2 Å⁵⁷^،⁵⁸^،⁵⁹ ، يتم تحديد غالبية الهياكل حول دقة 3-4 Å. يمكن أن تكون نمذجة الروابط في الخر?…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

حصلت SJ على منحة الدكتوراه من DAE-TIFR ، وتم الاعتراف بالتمويل. تقر KRV بمنحة DBT B-Life DBT / PR12422 / MED/31/287/2014 ودعم وزارة الطاقة الذرية ، حكومة الهند ، بموجب تحديد المشروع رقم. RTI4006.

Materials

CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more

References

Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM’: electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
Debreczeni, J. &. #. 2. 0. 1. ;., Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , (2022).
Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochimie. 62 (3), 735-746 (2023).
Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer’s perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).