Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy

Shaileshanand Jha; Sucharita Bose; Kutti R. Vinothkumar

doi:10.3791/66310

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochimie

מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

Published: July 19, 2024

doi:

10.3791/66310

Shaileshanand Jha*¹, Sucharita Bose*², Kutti R. Vinothkumar

¹National Centre for Biological Sciences,Tata Institute of Fundamental Research, ²Institute for Stem Cell Science and Regenerative Medicine

Summary

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

Abstract

פענוח יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנד בקומפלקס מקרומולקולרי חיוני להבנת המנגנון המולקולרי, התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיסו ופיתוח תרופות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ אלקטרונים בדגימה קריוגנית (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנים של מקרומולקולות ולחקור את אופן קשירת הליגנד ברזולוציה כמעט אטומית. זיהוי ומידול מולקולות שאינן חלבונים במפות cryoEM הוא לעתים קרובות מאתגר בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המולקולה המעניינת והרעש המובנה בנתונים. במאמר זה, הקוראים נחשפים לתוכנות ושיטות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדים, בניית מודלים ושכלול קואורדינטות אטומיות באמצעות מקרומולקולות נבחרות. אחת הדרכים הפשוטות ביותר לזהות נוכחות של ליגנד, כפי שמודגם עם אנזים האנולז, היא להחסיר את שתי המפות המתקבלות עם ובלי הליגנד. הצפיפות הנוספת של הליגנד עשויה לבלוט במפת ההפרשים גם בסף גבוה יותר. ישנם מקרים, כפי שמוצג במקרה של קולטן גלוטמט מטבולי mGlu₅, כאשר מפות הבדל פשוטות כאלה לא ניתן ליצור. השיטה שהוצגה לאחרונה לגזירת מפת ההשמטה Fo-Fc יכולה לשמש ככלי לאימות והדגמת נוכחות הליגנד. לבסוף, תוך שימוש בגלקטוזידאז β שנחקר היטב כדוגמה, מנותחת השפעת הרזולוציה על מידול הליגנדות ומולקולות הממס במפות cryoEM, ומוצגת השקפה על האופן שבו ניתן להשתמש ב- cryoEM בגילוי תרופות.

Introduction

תאים משיגים את תפקידיהם על ידי ביצוע אינספור תגובות כימיות בו זמנית ובאופן עצמאי, כל אחת מווסתת בקפידה כדי להבטיח את הישרדותם ואת יכולת ההסתגלות שלהם בתגובה לרמזים סביבתיים. זה מושג על ידי זיהוי מולקולרי, המאפשר ביומולקולות, במיוחד חלבונים, ליצור קומפלקסים חולפים או יציבים עם מקרומולקולות אחרות, כמו גם מולקולות קטנות או ליגנדות¹. לפיכך, אינטראקציות חלבון-ליגנד הן בסיסיות לכל התהליכים בביולוגיה, הכוללים את ויסות ביטוי ופעילות החלבון, זיהוי מצעים וקו-פקטורים על ידי אנזימים, כמו גם כיצד תאים תופסים ומעבירים אותות ^1,2. הבנה טובה יותר של התכונות הקינטיות, התרמודינמיות והמבניות של קומפלקס החלבון-ליגנד חושפת את הבסיס המולקולרי של אינטראקציית ליגנד וגם מאפשרת תכנון רציונלי של תרופות על ידי אופטימיזציה של אינטראקציה וספציפיות של תרופות. גישה חסכונית ומהירה יותר לחקר אינטראקציה בין חלבונים לליגנדים היא שימוש בעגינה מולקולרית, שהיא שיטה חישובית שלמעשה סורקת מגוון רחב של מולקולות קטנות וחוזה את מצב הקישור והזיקה של ליגנדות אלה לחלבוני מטרה³. עם זאת, ראיות ניסיוניות ממבנים ברזולוציה גבוהה שנקבעו על ידי עקיפה של קרני רנטגן (XRD), תהודה מגנטית גרעינית (NMR) או קריומיקרוסקופ אלקטרונים (cryoEM) מספקות את ההוכחה החיונית לתחזיות כאלה ומסייעות בפיתוח מפעילים או מעכבים חדשים ויעילים יותר למטרה נתונה. מאמר זה משתמש בקיצור ‘cryoEM’ כפי שנהוג להתייחס לטכניקה. עם זאת, קיים ויכוח מתמשך על בחירת המינוח הנכון, ולאחרונה הוצע המונח cryogenic-sample Electron Microscopy (cryoEM) כדי לציין שהדגימה נמצאת בטמפרטורה קריוגנית ומצולמת עם אלקטרונים⁴. באופן דומה, המפות הנגזרות מ- cryoEM נקראו פוטנציאל אלקטרונים, פוטנציאל אלקטרוסטטי או פוטנציאל קולומב, ולשם הפשטות, כאן אנו משתמשים במפות cryoEM 5,6,7,8,9,10.

למרות ש-XRD הייתה טכניקת תקן הזהב בקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה של קומפלקסים של ליגנד חלבונים, לאחר מהפכת הרזולוציה¹¹ cryoEM צברה תאוצה, כפי שעולה מהנחשול של מפות פוטנציאליות קולומב או מפות cryoEM שהופקדו במסד הנתונים של מיקרוסקופ אלקטרונים (EMDB)^12,13 במהלך השנים האחרונות¹⁴. הודות להתקדמות בהכנת דגימות, הדמיה ושיטות עיבוד נתונים, מספר תצהירי בנק נתוני החלבונים (PDB)¹⁴ המשתמשים ב- cryoEM גדל מ- 0.7% ל- 17% בין 2010 ל- 2020, כאשר כ- 50% מהמבנים שדווחו בשנת 2020 נקבעו ברזולוציה של 3.5 Å או טוב יותר^15,16. CryoEM אומץ במהירות על ידי קהילת הביולוגיה המבנית, כולל תעשיית התרופות, מכיוון שהוא מאפשר לחקור מקרומולקולות ביולוגיות גמישות ולא גבישיות, במיוחד חלבוני ממברנה וקומפלקסים מרובי חלבונים, ברזולוציה כמעט אטומית, להתגבר על תהליך ההתגבשות ולקבל גבישים דיפרקציה היטב הדרושים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה על ידי XRD.

מידול מדויק של הליגנד במפת cryoEM הוא בעל חשיבות עליונה, מכיוון שהוא משמש כשרטוט של קומפלקס ליגנד החלבונים ברמה המולקולרית. ישנם מספר כלים אוטומטיים לבניית ליגנדים המשמשים בקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן התלויים בצורה ובטופולוגיה של צפיפות הליגנד על מנת להתאים או לבנות את הליגנד לצפיפות אלקטרונים 17,18,19,20. עם זאת, אם הרזולוציה נמוכה מ- 3 Å, גישות אלה נוטות לייצר תוצאות פחות רצויות מכיוון שהתכונות הטופולוגיות שבהן הן תלויות לצורך הכרה ובנייה הופכות פחות מוגדרות. במקרים רבים, שיטות אלה הוכחו כלא יעילות במידול מדויק של ליגנדות למפות cryoEM, מכיוון שמפות אלה נקבעו בטווח הרזולוציה הנמוכה עד בינונית, בדרך כלל בין 3.5 Å-5 Å¹⁷.

השלב הראשון בקביעת מבנה תלת-ממדי של קומפלקס ליגנד חלבוני על ידי cryoEM כולל טיהור משותף של הליגנד עם החלבון (כאשר לליגנד יש זיקה גבוהה לחלבון) או דגירה של תמיסת החלבון עם הליגנד למשך זמן מסוים לפני הכנת הרשת. לאחר מכן, נפח דגימה קטן מונח על רשת TEM חורית מנוקה פלזמה, ואחריו הקפאת הבזק באתאן נוזלי ובסופו של דבר הדמיה עם cryo-TEM. תמונות ההקרנה הדו-ממדיות ממאות אלפי עד מיליוני חלקיקים בודדים ממוצעות כדי לשחזר מפה תלת-ממדית (תלת-ממדית) של פוטנציאל קולומב של המקרומולקולה. זיהוי ומידול ליגנדות ומולקולות ממס במפות אלה מציבים אתגרים משמעותיים במקרים רבים בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המפה (כלומר, הרזולוציה אינה אחידה על פני המקרומולקולה), גמישות באזור שבו הליגנד קשור והרעש בנתונים. רבים מכלי המידול, העידון וההדמיה שפותחו עבור XRD מותאמים כעת לשימוש ב- cryoEM לאותן מטרות 18,19,20,21. במאמר זה מוצגת סקירה כללית של שיטות ותוכנות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדות, בניית מודלים וחידוד הקואורדינטות הנגזרות מ- cryoEM. פרוטוקול שלב אחר שלב סופק כדי להמחיש את התהליכים המעורבים במידול ליגנדות באמצעות קומפלקסים ספציפיים של ליגנדים חלבוניים ברזולוציה ומורכבות משתנות.

השלב הראשון במידול ליגנדות במפות cryoEM כולל זיהוי צפיפות הליגנד (שאינו חלבון) במפה. אם קשירת ליגנד אינה גורמת לשינוי קונפורמטיבי כלשהו בחלבון, אזי חישוב מפת הפרשים פשוטה בין קומפלקס החלבון-ליגנד לבין חלבון האפו-חלבון מדגיש למעשה את האזורים בעלי צפיפות יתרה, מה שמרמז על נוכחות הליגנד. הבדלים כאלה ניתן לראות מיד, כפי שהוא דורש רק שתי מפות, ואפילו מפות ביניים במהלך תהליך של עידון 3D ניתן להשתמש כדי לבדוק אם הליגנד קיים. בנוסף, אם הרזולוציה גבוהה מספיק (<3.0 Å), מפת ההפרשים יכולה גם לספק תובנות לגבי המיקום של מולקולות מים, כמו גם יונים המקיימים אינטראקציה עם הליגנד ושאריות החלבון.

בהיעדר מפת חלבון אפו, ניתן כעת להשתמש ב- Servalcat²², הזמין ככלי עצמאי ושולב גם בחבילת התוכנה CCP-EM^23,24 כחלק מעידון Refmac ובשחרור CCP4 8.0^25,26. Servalcat מאפשר חישוב של מפת הפרש משוקלל FSC (Fo-Fc) באמצעות חצאי מפות לא מחודדות ומודל אפופרוטאין כקלט. מפת השמיטה Fo-Fc מייצגת את הפער בין המפה הניסויית (Fo) לבין המפה הנגזרת מהמודל (Fc). בהיעדר ליגנד במודל, צפיפות חיובית במפת Fo-Fc החופפת למפת EM ניסיונית בדרך כלל מרמזת על נוכחות הליגנד. ההנחה כאן היא ששרשרת החלבונים מותאמת היטב במפה, והצפיפות החיובית הנותרת מצביעה על מיקום הליגנד. עם זאת, חשוב לבחון היטב האם הצפיפות החיובית נובעת מאי דיוקים במידול, כגון רוטמר שגוי של שרשרת צדדית של חלבון.

השלב השני כרוך בהשגה או יצירה של קובץ קואורדינטות קרטזי של הליגנד עם גאומטריה מוגדרת היטב מהמידע הכימי הזמין. ליגנדות סטנדרטיות (לדוגמה, ATP ו-NADP⁺) שכבר זמינות בספריית המונומרים CCP4 יכולות לשמש לעידון על-ידי אחזור קובצי הקואורדינטות והגיאומטריה באמצעות קוד ההצטרפות המונומרי שלהם. עם זאת, עבור ליגנדות לא ידועות או לא סטנדרטיות, כלים שונים זמינים ליצירת קובצי הגיאומטריה. חלק מהדוגמאות כוללות את eLBOW²⁷ – (בונה ליגנדים אלקטרוניים ושולחן עבודה אופטימיזציה) בפניקס²⁸, לידיה – כלי מובנה ב- Coot²⁹, JLigand/ACEDRG^30,31, CCP-EM^23,24, Ligprep^{32-מודול} של Glide בתוך חבילת שרדינגר. לאחר מכן קובץ קואורדינטות הליגנד מותאם בצפיפות, מונחה הן על ידי מפת ה- cryoEM הניסיונית והן על ידי מפת ההפרשים ב- Coot. זה ואחריו עידון החלל האמיתי בפניקס²⁸ או עידון הדדי ב Refmac³³. תחנת עבודה לינוקס או מחשב נייד מצויד כרטיס גרפי טוב ואת התוכנה הנ”ל נדרש. רוב התוכניות הללו כלולות בסוויטות שונות. CCP-EM²⁴ו- Phenix²⁸ זמינים באופן חופשי למשתמשים אקדמיים וכוללים מגוון כלים המשמשים במאמר זה, כולל Coot, Refmac5 33,34,35,36, Servalcat, phenix.real_space_refine וכו ‘. באופן דומה, Chimera³⁷, ו- ChimeraX³⁸ מספקים רישיונות בחינם למשתמשים אקדמיים.

Protocol

1. מידול phosphoenolpyruvate (PEP) ב enolase מ Mycobacterium tuberculosis זיהוי צפיפות ליגנד במפת cryoEM של קומפלקס PEP-enolaseהורד את חצאי המפות הלא מחודדות (emd_30988_additional_1.map ו- emd_30988_additional_2.map) של apo-enolase מהנתונים הנוספים ב- EMDB (ראה טבלת חומרים). פתח את ChimeraX (ראה טבלת חומרים). פתח את ח?…

Representative Results

דוגמה 1האנזים אנולאז משחפת מזרז את השלב הלפני אחרון של גליקוליזה וממיר 2-פוספוגליצראט לפוספונולפירובט (PEP), שהוא מתווך חיוני למספר מסלולים מטבוליים44,45. נתוני CryoEM עבור דגימות apo-enolase ו-PEP enolase נאספו באותו גודל פיקסלים של 1.07 Å, ועיבוד התמונה בוצע ?…

Discussion

השיפורים בחומרה ובתוכנה של המיקרוסקופ הביאו לעלייה במספר מבני ה-cryoEM בשנים האחרונות. למרות שהרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה כרגע ב- cryoEM של חלקיק יחיד היא 1.2 Å 57,58,59, רוב המבנים נקבעים סביב רזולוציית 3-4 Å. מידול ליגנדות במפות ברזולוציה בינונית …

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ש”י הוא מקבל את מלגת הדוקטורט מ- DAE-TIFR, והמימון מוכר. KRV מכירה במענק DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ובתמיכת המחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו, תחת פרויקט זיהוי מס’. RTI4006.

Materials

CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more

References

Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z. Insights into the molecular mechanisms of protein-ligand interactions by molecular docking and molecular dynamics simulation: a case of oligopeptide binding protein. Comput Math Methods Med. 4, 3502514 (2018).
Grinter, S. Z., Zou, X. Challenges, applications, and recent advances of protein-ligand docking in structure-based drug design. Molecules. 19 (7), 10150-10176 (2014).
Henderson, R., Hasnain, S. Cryo-EM’: electron cryomicroscopy, cryo electron microscopy or something else. IUCrJ. 10 (5), 519-520 (2023).
Rosenthal, P. B. A potential difference for single-particle cryo-EM. IUCrJ. 6, 988-989 (2019).
Wang, J., Moore, P. B. On the interpretation of electron microscopic maps of biological macromolecules. Prot Sci. 26 (1), 122-129 (2017).
Murshudov, G. N. Refinement of atomic structures against cryo-EM Maps. Meth Enzymol. 579, 277-305 (2016).
Kulik, M., Chodkiewicz, M. L., Dominiak, P. M. Theoretical 3D electron diffraction electrostatic potential maps of proteins modeled with a multipolar pseudoatom data bank. Acta Crystallogr D Struct Biol. 78 (8), 1010-1020 (2022).
Yonekura, K., Kato, K., Ogasawara, M., Tomita, M., Toyoshima, C. Electron crystallography of ultrathin 3D protein crystals: Atomic model with charges. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (11), 3368-3373 (2015).
Mu, X., Gillman, C., Nguyen, C., Gonen, T. An overview of microcrystal electron diffraction (MicroED). Annu Rev Biochem. 90, 431-450 (2021).
Kühlbrandt, W. The resolution revolution. Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).
Lawson, C. L., et al. EMDataBank unified data resource for 3DEM. Nucleic Acids Res. 44, 396-403 (2016).
Lees, J. A., Dias, J. M., Han, S. Applications of Cryo-EM in small molecule and biologics drug design. Biochem Soc Trans. 49 (6), 2627-2638 (2021).
Robertson, M. J., Meyerowitz, J. G., Skiniotis, G. Drug discovery in the era of cryo-electron microscopy. Trends Biochem Sci. 47 (2), 124-135 (2022).
Muenks, A., Zepeda, S., Zhou, G., Veesler, D., DiMaio, F. Automatic and accurate ligand structure determination guided by cryo-electron microscopy maps. Nat Commun. 14, 1164 (2023).
Oldfield, T. J. X-ligand: An application for the automated addition of flexible ligands into electron density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 57 (5), 696-705 (2001).
Zwart, P. H., Langer, G. G., Lamzin, V. S. Modelling bound ligands in protein crystal structures. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60, 2230-2239 (2004).
Terwilliger, T. C., Klei, H., Adams, P. D., Moriarty, N. W., Cohn, J. D. Automated ligand fitting by core-fragment fitting and extension into density. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62 (8), 915-922 (2006).
Casañal, A., Lohkamp, B., Emsley, P. Current developments in Coot for macromolecular model building of Electron Cryo-microscopy and Crystallographic Data. Prot Sci. 29 (4), 1069-1078 (2020).
Yamashita, K., Palmer, C. M., Burnley, T., Murshudov, G. N. Cryo-EM single-particle structure refinement and map calculation using Servalcat. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (10), 1282-1291 (2021).
Wood, C. Collaborative computational project for electron cryo-microscopy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 123-126 (2015).
Burnley, T., Palmer, C. M., Winn, M. Recent developments in the CCP-EM software suite. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (6), 469-477 (2017).
Potterton, E., McNicholas, S., Krissinel, E., Cowtan, K., Noble, M. The CCP4 molecular-graphics project. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 58 (11), 1955-1957 (2002).
Agirre, J. The CCP4 suite: Integrative software for macromolecular crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 79 (6), 449-461 (2023).
Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65 (10), 1074-1080 (2009).
Adams, P. D. A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 66 (2), 213-221 (2010).
Emsley, P., Cowtan, K. Coot: Model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 60 (12), 2126-2132 (2004).
Debreczeni, J. &. #. 2. 0. 1. ;., Emsley, P. Handling ligands with Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 425-430 (2012).
Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallogr D Struct Biol. 73 (2), 112-122 (2017).
Schrödinger. LigPrep. Schrödinger Release 2022-1: Schrödinger, LLC. , (2022).
Brown, A. Tools for macromolecular model building and refinement into electron cryo-microscopy reconstructions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 71 (1), 136-153 (2015).
Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 53, 240-255 (1997).
Kovalevskiy, O., Nicholls, R. A., Long, F., Carlon, A., Murshudov, G. N. Overview of refinement procedures within REFMAC 5: Utilizing data from different sources. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (3), 215-227 (2018).
Winn, M. D., et al. Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67 (4), 235-242 (2011).
Pettersen, E. F., et al. UCSF Chimera – A visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem. 25 (13), 1605-1612 (2004).
Pettersen, E. F., et al. UCSF ChimeraX: Structure visualization for researchers, educators, and developers. Prot Sci. 30 (1), 70-82 (2021).
Lamb, A. L., Kappock, T. J., Silvaggi, N. R. You are lost without a map: Navigating the sea of protein structures. Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1854 (4), 256-268 (2015).
Ehinger, S., Schubert, W. D., Bergmann, S., Hammerschmidt, S., Heinz, D. W. Plasmin(ogen)-binding α-Enolase from streptococcus pneumoniae: Crystal structure and evaluation of plasmin(ogen)-binding sites. J Mol Biol. 343 (4), 997-1005 (2004).
Tjia-Fleck, S., Readnour, B. M., Ayinuola, Y. A., Castellino, F. J. High-Resolution single-particle cryo-EM hydrated structure of streptococcus pyogenes enolase offers insights into its function as a plasminogen receptor. Biochimie. 62 (3), 735-746 (2023).
Pfab, J., Si, D. Automated threshold selection for cryo-EM density maps. ACM-BCB 2019. Proceedings of the 10th ACM International Conference on Bioinformatics, Computational Biology and Health Informatics. , 161-166 (2019).
Rahi, A., et al. Enolase of Mycobacterium tuberculosis is a surface exposed plasminogen binding protein. Biochim Biophys Acta Gen Subj. 1861 (1), 3355-3364 (2017).
Henderson, B., Martin, A. Bacterial virulence in the moonlight: Multitasking bacterial moonlighting proteins are virulence determinants in infectious disease. Infect Immun. 79 (9), 3476-3491 (2011).
Scheres, S. H. W. A bayesian view on cryo-EM structure determination. J Mol Biol. 415 (2), 406-418 (2012).
Zivanov, J., et al. New tools for automated high-resolution cryo-EM structure determination in RELION-3. Elife. 7, 42166 (2018).
Mohammed, A., et al. Structural snapshots of Mycobacterium tuberculosis enolase reveal dual mode of 2PG binding and its implication in enzyme catalysis. IUCrJ. 10 (6), 738-753 (2023).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Nucleic Acids Res. 28 (1), 3-21 (2000).
Nasrallah, C. Agonists and allosteric modulators promote signaling from different metabotropic glutamate receptor 5 conformations. Cell Rep. 36 (9), 109648 (2021).
Doak, B. C., Norton, R. S., Scanlon, M. J. The ways and means of fragment-based drug design. Pharmacol Ther. 167, 28-37 (2016).
Baker, M. Fragment-based lead discovery grows up. Nat Rev Drug Discov. 12 (1), 5-7 (2013).
Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (3), 4309 (2019).
Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
Saur, M. Fragment-based drug discovery using cryo-EM. Drug Discov Today. 25 (3), 485-490 (2020).
Maki-Yonekura, S., Kawakami, K., Takaba, K., Hamaguchi, T., Yonekura, K. Measurement of charges and chemical bonding in a cryo-EM structure. Commun Chem. 6 (1), 98 (2023).
Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587 (7832), 157-161 (2020).
Nakane, T. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587 (7832), 152-156 (2020).
Pintilie, G. Measurement of atom resolvability in cryo-EM maps with Q-scores. Nat Methods. 17 (3), 328-334 (2020).
Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. CryoSPARC: Algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
Koehl, A. Structural insights into the activation of metabotropic glutamate receptors. Nature. 566 (7742), 79-84 (2019).
Scheres, S. H. W. Classification of structural heterogeneity by maximum-likelihood methods. Meth Enzymol. 482, 295-320 (2010).
Carugo, O. Atomic displacement parameters in structural biology. Amino Acids. 50 (7), 775-786 (2018).
Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution Cryo-EM maps and models: A crystallographer’s perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
Masmaliyeva, R. C., Babai, K. H., Murshudov, G. N. Local and global analysis of macromolecular atomic displacement parameters. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (10), 926-937 (2020).
Merritt, E. A. To B or not to B: A question of resolution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 68 (4), 468-477 (2012).
Afonine, P. V., et al. Real-space refinement in PHENIX for cryo-EM and crystallography. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74 (60), 531-544 (2018).
Roberts on, M. J., van Zundert, G. C. P., Borrelli, K., Skiniotis, G. GemSpot: A pipeline for robust modeling of ligands into Cryo-EM maps. Structure. 28 (6), 707-716 (2020).
Weis, F., Hagen, W. J. H. Combining high throughput and high quality for cryo-electron microscopy data collection. Acta Crystallogr D Struct Biol. 76 (8), 724-728 (2020).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citer Cet Article

Jha, S., Bose, S., Vinothkumar, K. R. Modeling Ligands into Maps Derived from Electron Cryomicroscopy. J. Vis. Exp. (209), e66310, doi:10.3791/66310 (2024).