Le présent protocole décrit des tests d’infection pour interroger l’adhérence, l’invasion et la réplication intracellulaire de Shigella à l’aide de lignées cellulaires épithéliales in vitro .
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Article de méthode
Analyses des infections des cellules épithéliales avec Shigella
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’agent pathogène bactérien entérique adapté à l’homme, Shigella , provoque des millions d’infections chaque année, crée des effets de croissance à long terme chez les patients pédiatriques et est l’une des principales causes de décès dus à la diarrhée dans le monde. L’infection induit une diarrhée aqueuse ou sanglante en raison du passage de l’agent pathogène dans le tractus gastro-intestinal et de l’infection des cellules épithéliales tapissant le côlon. Avec l’augmentation stupéfiante de la résistance aux antibiotiques et le manque actuel de vaccins approuvés, des protocoles de recherche standardisés sont essentiels pour étudier ce formidable agent pathogène. Ici, des méthodologies sont présentées pour examiner la pathogenèse moléculaire de Shigella à l’aide d’analyses in vitro de l’adhérence, de l’invasion et de la réplication intracellulaire bactériennes dans les cellules épithéliales du côlon. Avant les analyses d’infection, le phénotype de virulence des colonies de Shigella a été vérifié par l’absorption du colorant rouge du Congo sur des plaques de gélose. Des milieux de laboratoire supplémentés peuvent également être envisagés pendant la culture bactérienne pour imiter les conditions in vivo . Les cellules bactériennes sont ensuite utilisées dans un protocole standardisé pour infecter les cellules épithéliales du côlon dans des plaques de culture tissulaire à une multiplicité d’infection établie avec des adaptations pour analyser chaque stade de l’infection. Pour les tests d’observance, les cellules de Shigella sont incubées avec des niveaux de milieu réduits pour favoriser le contact bactérien avec les cellules épithéliales. Pour les essais d’invasion et de réplication intracellulaire, la gentamicine est appliquée à différents intervalles de temps pour éliminer les bactéries extracellulaires et permettre l’évaluation de l’invasion et/ou la quantification des taux de réplication intracellulaire. Tous les protocoles d’infection dénombrent les bactéries adhérentes, envahies et/ou intracellulaires en diluant en série les lysats de cellules épithéliales infectées et en plaquant les unités formant des colonies bactériennes par rapport aux titres infectieux sur des plaques de gélose rouge du Congo. Ensemble, ces protocoles permettent une caractérisation et des comparaisons indépendantes pour chaque stade de l’infection à Shigella des cellules épithéliales afin d’étudier avec succès cet agent pathogène.
Introduction
Les maladies diarrhéiques causées par des bactéries pathogènes entériques constituent un fardeau important pour la santé mondiale. En 2016, les maladies diarrhéiques étaient responsables de 1,3 million de décès dans le monde et étaient la quatrième cause de décès chez les enfants de moins de cinq ans 1,2. Shigella, un pathogène bactérien entérique à Gram négatif, est l’agent causal de la shigellose, une cause majeure de décès diarrhéiques dans le monde3. La shigellose provoque une morbidité et une mortalité importantes chaque année chez les enfants des pays à revenu faible et i....
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Protocole
1. Préparation des réactifs et des matériaux
REMARQUE : Tous les volumes sont cohérents avec un test utilisant deux plaques à 6 puits.
- Milieu TSB : Ajouter 0,5 L d’eau désionisée (DI) à 15 g de milieu de bouillon de soja tryptique (TSB, voir le tableau des matières) et autoclave. Conserver à température ambiante.
- Milieu de sels biliaires (BST + BS) : Pour préparer du BST contenant 0,4 % (p/v) de sels biliaires, remettre en suspension 0,06 g de sels biliaires (BS, voir le tableau des matières) dans 15 mL de BSB autoclave. Stériliser le filtre à l’aide d’un filtre PES de 0....
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Résultats
Des tests d’adhérence, d’invasion et de réplication intracellulaire ont été effectués en comparant S. flexneri 2457T de type sauvage (WT) à S. flexneri ΔVF (ΔVF), un mutant supposé réguler négativement la virulence de Shigella. Étant donné que Shigella utilise les sels biliaires comme signal pour réguler la virulence 17,18,47, des expériences ont été réalisées après une sous-culture bactérienne dans un milieu TSB ainsi qu’une supplémentation en sels biliaires à 0,4 % (p/v)
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Discussion
Ce protocole décrit un ensemble de trois tests standardisés pour étudier l’adhérence, l’invasion et la réplication intracellulaire de Shigella des cellules épithéliales intestinales. Bien que ces méthodes ne soient que des versions modifiées des tests classiques de gentamicine utilisés pour étudier l’invasion et la réplication intracellulaire de divers agents pathogènes bactériens dans les cellules hôtes 49,50,51, des considérations particulières doivent être appliquées lors de l’étude de.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Le soutien aux auteurs comprend le département de pédiatrie du Massachusetts General Hospital, la subvention 2022A009041 du Comité exécutif sur le financement provisoire du soutien à la recherche, la subvention R21AI146405 de l’Institut national des allergies et des maladies infectieuses et la subvention de l’Institut national du diabète et des maladies digestives et rénales Centre de recherche sur la nutrition et l’obésité à Harvard (NORCH) 2P30DK040561-26. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mu ; m Filtre PES | Millipore-Sigma | SCGP00525 | Filtre stérile en polyéthersulfone pour la stérilisation jusqu’à 50 mL de milieux |
| Tubes de culture de 14 mL | Corning | 352059 | 17 mm x 100 mm Tubes à essai en polypropylène de 17 mm x 100 mm avec capuchon |
| Tubes coniques de 50 mL de | Corning | 430829 | de 50 mL Tubes à centrifuger à fond conique en polypropylène transparent avec bouchon étanche |
| Plaques de culture tissulaire à 6 puits | Corning | 3516 | Les plaques sont traitées pour une fixation cellulaire optimale |
| Sels biliaires | Sigma-Aldrich | B8756 | Rapport 1:1 entre le cholate et le désoxycholate |
| Colorant rouge du Congo | Sigma-Aldrich | C6277 | Un colorant diazo anionique à base de benzidine, pureté >85 % |
| Lame de chambre de comptage cellulaire Countess | Invitrogen | C10283 | À utiliser avec le compteur cellulaire automatisé Countess |
| Dimethyl sulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 A, | un réactif organique hautement polaire |
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 10569-010 | Le DMEM est complété par du glucose élevé, du pyruvate de sodium, du GlutaMAX et du |
| sérum bovin fœtal rouge phénolique (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | Gentamicine stérile inactivée par la chaleur |
| Sigma-Aldrich | G3632 | La concentration du stock est de 50 mg/mL | |
| Lignée cellulaire HT-29 | ATCC | HTB-38 | Lignée cellulaire d’adénocarcinome ; colorectal en origine |
| Film de paraffine | Bemis | PM999 | Film d’étanchéité de laboratoire |
| Boîtes de Pétri | Thermo Fisher Scientific | FB0875713 | 100 mm x 15 mm Boîtes de Pétri pour milieux solides |
| Saline tamponnée au phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | 1x concentration ; pH 7,4 |
| Sélectionner gélose | Invitrogen | 30391023 | Un mélange de polysaccharides extraits des parois cellulaires d’algues rouges pour fabriquer des milieux de placage bactérien |
| Fioles T75 | Corning | 430641U | Fioles de culture tissulaire |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Un tensioactif et émulsifiant non ionique commun. |
| Coloration au bleu de trypan | Invitrogen | T10282 | Un colorant pour détecter les cellules mortes de culture de tissus ; seules les cellules vivantes peuvent exclure le colorant |
| Trypsine-EDTA | Gibco | 25200-056 | Réactif pour la dissociation cellulaire pour l’entretien et le passage des lignées cellulaires |
| Bouillon de soja tryptique (TSB) | Sigma-Aldrich | T8907 | Milieu de croissance bactérienne |
Références
- Karambizi, N. U., McMahan, C. S., Blue, C. N., Temesvari, L. A. Global estimated Disability-Adjusted Life-Years (DALYs) of diarrheal diseases: A systematic analysis of data from 28 years of the global burden of disease study. PloS one. 16 (10), e0259077(2021).
- WHO.
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