Adenoassocierat virus produceras i suspensionscellodling och renas genom dubbel jodixanolgradientcentrifugering. Åtgärder ingår för att öka det totala virusutbytet, minska risken för virusutfällning och ytterligare koncentrera den slutliga virusprodukten. Förväntade slutliga titrar når 1012 viruspartiklar/ml och är lämpliga för preklinisk in vivo-användning .
Detta protokoll beskriver produktion och rening av rekombinant adenoassocierat virus (rAAV) genom jodixanolgradientcentrifugering, en serotypagnostisk metod för rening av AAV som först beskrevs 1999. rAAV-vektorer används ofta i genterapiapplikationer för att leverera transgener till olika mänskliga celltyper. I detta arbete produceras det rekombinanta viruset genom transfektion av Expi293-celler i suspensionsodling med plasmider som kodar för transgenen, vektorkapsiden och adenovirala hjälpargener. Iodixanol densitetsgradientcentrifugering renar fulla AAV-partiklar baserat på partikeldensitet. Dessutom ingår tre steg i denna nu allestädes närvarande metod för att öka det totala virusutbytet, minska risken för utfällning på grund av kontaminerande proteiner och ytterligare koncentrera den slutliga virusprodukten: utfällning av viruspartiklar från cellmedia med hjälp av en lösning av polyetylenglykol (PEG) och natriumklorid, införandet av en andra omgång av jodixanolgradientcentrifugering, och buffertutbyte via ett centrifugalfilter. Med hjälp av denna metod är det möjligt att konsekvent uppnå titrar i intervallet 1012 viruspartiklar/ml med exceptionell renhet för in vivo-användning .
Rekombinanta adenoassocierade virala (rAAV) vektorer är allmänt använda verktyg för behandling av genetiska sjukdomar, inklusive spinal muskelatrofi, retinal dystrofi och hemofili A 1,2,3. rAAV-vektorer är konstruerade för att sakna virala gener som finns i vildtyp AAV4, ett litet, icke-hölje ikosaedriskt virus med ett linjärt enkelsträngat 4,7 kb DNA-genom. AAV upptäcktes först på 1960-talet som en förorening av adenoviruspreparat5. Trots sin lilla kapsidstorlek, som begränsar storleken på transgenen som kan förpackas till maximalt 4,9 kb exklusive ITR6, är AAV användbar för transgenleverans eftersom den är icke-patogen hos människor, tillåter uttryck av transgen i många delande och icke-delande celltyper och har begränsade immunogena effekter7.
Som medlemmar av släktet dependoparvovirus är produktionen av rAAVs beroende av uttrycket av hjälpgener som finns i adenovirus eller herpes simplexvirus8. Flera strategier för att producera rAAV har utvecklats, men produktion i HEK293-celler transformerade med adenovirala E1A/E1B-hjälpargener är den mest etablerade metoden som används idag9. Det allmänna tillvägagångssättet för rAAV-produktion börjar med transfektionen av HEK293-celler med tre plasmider som innehåller transgenen inom inverterade terminalupprepningar (ITR), AAV-rep – och cap-gener respektive ytterligare adenovirala hjälpgener. Sjuttiotvå timmar efter transfektionen skördas cellerna och bearbetas för att rena rAAV som innehåller transgenen.
I utvecklingen av nya rAAV-vektorer för terapeutiska ändamål är ett viktigt mål att producera vektorer med ökad transduktionseffektivitet. En ökning av transduktionseffektiviteten hos målceller skulle innebära en minskning av den nödvändiga kliniska dosen av rAAV, vilket minskar sannolikheten för negativa immunogena effekter som sträcker sig från antikroppsmedierad neutralisering till akut toxicitet10,11. För att förbättra transduktionseffekten hos rAAV-vektorer kan förändringar göras i det förpackade genomet eller i kapsiden. Genomförbara metoder för att finjustera transduktionseffektiviteten via paketerad genomdesign inkluderar inkorporering av starka och vävnadsspecifika promotorer, genomtänkt urval av mRNA-bearbetningselement och kodningssekvensoptimering för att förbättra translationseffektiviteten12. Förändringar av kapsiden görs med målet att öka tropismen för mänskliga celltyper. Ansträngningar för att utveckla nya rAAV-transgenleveransvektorkapsider kännetecknas i allmänhet av ett fokus på antingen rationell design av AAV-kapsider med specifika mutationer riktade mot specifika cellreceptorer eller riktad evolution för att identifiera kapsider med tropism för specifika celltyper från kombinatoriska kapsidbibliotek med hög komplexitet utan att rikta in sig på en specifik receptor (även om vissa grupper kombinerar dessa tillvägagångssätt)13, 14,15. I den riktade evolutionsmetoden konstrueras kombinatoriska kapsidbibliotek med hjälp av en särskild serotypryggrad med muterade variabla regioner på kapsidens utsida16. Kombinatoriska kapsidbibliotek är ofta konstruerade av AAV-serotyper som inte har sitt ursprung hos människor, vilket minskar risken för redan existerande immunitet vid klinisk användning10. Därför är reningsmetoder som kan tillämpas på alla serotyper idealiska för att eliminera behovet av serotypspecifik optimering för de mindre vanliga serotyperna som fungerar som ryggrad för dessa bibliotek.
Iodixanol densitetsgradientcentrifugering används för att rena höga titrar av rAAV med hög infektionsförmåga17. I detta protokoll produceras rAAV i suspensionscellodling för att minska mängden arbete som behövs för att producera stora titrar av AAV. Ett centrifugeringssteg ingår också för att rensa celllysat för att minska förekomsten av kontaminerande proteiner och minska risken för virusutfällning. Detta protokoll är en kostnadseffektiv metod för att producera preparat med rAAV med hög renhet som är lämpliga för preklinisk användning.
Protokollet för dubbel joddensitetsgradientrening är den universella metoden eftersom det är tillämpligt på alla AAV-mutantvarianter, oavsett deras receptorspecificitet. Tidiga metoder för AAV-rening förlitade sig på partikeldensitet och inkluderade isopyklonisk centrifugering i CsCl och kontinuerlig sackarosdensitetsgradientcentrifugering19. Senare utvecklades serotypspecifika metoder, som använde sig av monoklonala antikroppar bundna till Sepharose kolumn20. En n…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |