Adeno-geassocieerd virus wordt geproduceerd in suspensiecelkweek en gezuiverd door centrifugatie met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt. Er zijn stappen opgenomen om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op virusneerslag te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren. De verwachte uiteindelijke titers bereiken 10tot 12 virale deeltjes/ml en zijn geschikt voor preklinisch in vivo gebruik.
Dit protocol beschrijft de productie en zuivering van recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) door middel van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie, een serotype-agnostische methode om AAV te zuiveren die voor het eerst werd beschreven in 1999. rAAV-vectoren worden veel gebruikt in gentherapietoepassingen om transgenen af te leveren aan verschillende menselijke celtypen. In dit werk wordt het recombinante virus geproduceerd door transfectie van Expi293-cellen in suspensiecultuur met plasmiden die coderen voor de transgen-, vectorcapside- en adenovirale helpergenen. Iodixanol dichtheidsgradiëntcentrifugatie zuivert volledige AAV-deeltjes op basis van deeltjesdichtheid. Bovendien zijn er drie stappen opgenomen in deze nu alomtegenwoordige methodologie om de totale virusopbrengst te verhogen, het risico op neerslag als gevolg van besmettende eiwitten te verminderen en het uiteindelijke virusproduct verder te concentreren, respectievelijk: precipitatie van virale deeltjes uit celmedia met behulp van een oplossing van polyethyleenglycol (PEG) en natriumchloride, de introductie van een tweede ronde van jodixanoldichtheidsgradiëntcentrifugatie, en bufferuitwisseling via een centrifugaalfilter. Met behulp van deze methode is het mogelijk om consistent titers te bereiken in het bereik van 1012 virale deeltjes/ml met een uitzonderlijke zuiverheid voor in vivo gebruik.
Recombinante adeno-geassocieerde virale (rAAV) vectoren zijn veelgebruikte hulpmiddelen voor de behandeling van genetische ziekten, waaronder spinale musculaire atrofie, retinale dystrofie en hemofilie A 1,2,3. rAAV-vectoren zijn zo gemanipuleerd dat ze geen virale genen hebben die aanwezig zijn in wildtype AAV4, een klein, niet-envelop icosahedraal virus met een lineair enkelstrengs DNA-genoom van 4,7 kb. AAV werd voor het eerst ontdekt in de jaren 1960 als een verontreiniging van adenoviruspreparaten. Ondanks de kleine capside-grootte, die de grootte van het transgen dat kan worden verpakt beperkt tot maximaal 4,9 kb exclusief ITR’s6, is AAV nuttig voor transgenafgifte omdat het niet-pathogeen is bij mensen, expressie van transgen mogelijk maakt in veel delende en niet-delende celtypen en beperkte immunogene effecten heeft7.
Als leden van het geslacht dependoparvovirus is de productie van rAAV’s afhankelijk van de expressie van helpergenen die aanwezig zijn in adenovirus of herpes simplex-virus8. Er zijn verschillende strategieën ontwikkeld om rAAV te produceren, maar de productie in HEK293-cellen die zijn getransformeerd met de adenovirale E1A/E1B-helpergenen is de meest gevestigde methode die tegenwoordig wordt gebruikt. De algemene benadering van rAAV-productie begint met de transfectie van HEK293-cellen met drie plasmiden die het transgen bevatten in respectievelijk omgekeerde terminale herhalingen (ITR’s), AAV-rep- en cap-genen en aanvullende adenovirale helpergenen. Tweeënzeventig uur na transfectie worden cellen geoogst en verwerkt om rAAV te zuiveren die het transgen bevat.
Bij de ontwikkeling van nieuwe rAAV-vectoren voor therapeutische doeleinden is een belangrijk doel het produceren van vectoren met een verhoogde transductie-efficiëntie. Een toename van de transductie-efficiëntie van doelcellen zou een verlaging van de noodzakelijke klinische dosis rAAV betekenen, waardoor de kans op nadelige immunogene effecten, variërend van antilichaam-gemedieerde neutralisatie tot acute toxiciteiten, wordt verkleind10,11. Om de transductie-efficiëntie van rAAV-vectoren te verbeteren, kunnen wijzigingen worden aangebracht in het verpakte genoom of in de capside. Haalbare methoden om de werkzaamheid van transductie af te stemmen via verpakt genoomontwerp zijn onder meer de integratie van sterke en weefselspecifieke promotors, doordachte selectie van mRNA-verwerkingselementen en optimalisatie van coderingssequenties om de translatie-efficiëntie te verbeteren12. Wijzigingen aan de capside worden aangebracht met als doel het tropisme voor menselijke doelceltypen te vergroten. Inspanningen om nieuwe rAAV-capsiden voor transgenafgifte te ontwikkelen, worden over het algemeen gekenmerkt door een focus op ofwel rationeel ontwerp van AAV-capsiden met specifieke mutaties gericht op specifieke celreceptoren, ofwel gerichte evolutie om capsiden met tropisme te identificeren voor specifieke celtypen uit combinatorische capsidebibliotheken met hoge complexiteit zonder zich te richten op één specifieke receptor (hoewel sommige groepen deze benaderingen combineren)13, 14,15. In de gerichte evolutiebenadering worden combinatorische capsidebibliotheken geconstrueerd met behulp van een bepaalde serotype-ruggengraat met gemuteerde variabele regio’s aan de buitenkant van de capside16. Combinatorische capsidebibliotheken zijn vaak opgebouwd uit AAV-serotypen die niet van mensen afkomstig zijn, waardoor het risico op reeds bestaande immuniteit tijdens klinisch gebruik afneemt10. Daarom zijn zuiveringsmethoden die op elk serotype kunnen worden toegepast, ideaal om de noodzaak van serotype-specifieke optimalisatie voor de minder vaak gebruikte serotypen die als ruggengraat voor deze bibliotheken dienen, te elimineren.
Centrifugatie met de dichtheidsgradiënt van Iodixanol wordt gebruikt om hoge titers van rAAV met een hoge besmettelijkheid te zuiveren17. In dit protocol wordt rAAV geproduceerd in suspensiecelkweek om de hoeveelheid arbeid die nodig is om grote titers van AAV te produceren te verminderen. Er is ook een centrifugatiestap opgenomen om cellysaat te zuiveren om de aanwezigheid van verontreinigende eiwitten te verminderen en het risico op virusneerslag te verminderen. Dit protocol is een kosteneffectieve methode om preparaten met een hoge zuiverheid rAAV te produceren die geschikt zijn voor preklinisch gebruik.
Het zuiveringsprotocol met dubbele jodixanoldichtheidsgradiënt is de universele methode omdat het van toepassing is op alle AAV-mutante varianten, ongeacht hun receptorspecificiteit. Vroege methoden van AAV-zuivering waren gebaseerd op deeltjesdichtheid en omvatten isopycnische centrifugatie in CsCl en continue sucrosedichtheidsgradiëntcentrifugatie19. Later werden serotype-specifieke benaderingen ontwikkeld, die gebruik maakten van monoklonale antilichamen gebonden aan Sepharose-kolommen<sup cl…
The authors have nothing to disclose.
Geen.
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |