Producción de cultivos en suspensión y purificación de virus adenoasociados mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol para aplicaciones in vivo
Summary
El virus adenoasociado se produce en cultivo celular en suspensión y se purifica mediante centrifugación de doble gradiente de densidad de yodixanol. Se incluyen medidas para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación del virus y concentrar aún más el producto final del virus. Los títulos finales esperados alcanzan las 1012 partículas virales/ml y son adecuados para el uso preclínico in vivo .
Abstract
Este protocolo describe la producción y purificación de virus adenoasociados recombinantes (rAAV) mediante centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, un método independiente del serotipo para purificar AAV descrito por primera vez en 1999. Los vectores rAAV se utilizan ampliamente en aplicaciones de terapia génica para administrar transgenes a varios tipos de células humanas. En este trabajo, el virus recombinante se produce por transfección de células Expi293 en cultivo en suspensión con plásmidos que codifican los genes transgénicos, de la cápside del vector y de los genes auxiliares adenovirales. La centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol purifica las partículas AAV completas en función de la densidad de partículas. Además, se incluyen tres pasos en esta metodología ahora omnipresente para aumentar el rendimiento total del virus, disminuir el riesgo de precipitación debido a proteínas contaminantes y concentrar aún más el producto final del virus, respectivamente: precipitación de partículas virales de medios celulares utilizando una solución de polietilenglicol (PEG) y cloruro de sodio, la introducción de una segunda ronda de centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol, y el intercambio de tampón a través de un filtro centrífugo. Con este método, es posible lograr títulos consistentes en el rango de 10a 12 partículas virales/ml de pureza excepcional para uso in vivo .
Introduction
Los vectores virales adenoasociados recombinantes (rAAV) son herramientas ampliamente utilizadas para el tratamiento de enfermedades genéticas, como la atrofia muscular espinal, la distrofia retiniana y la hemofilia A 1,2,3. Los vectores rAAV están diseñados para carecer de genes virales presentes en el AAV4 de tipo salvaje, un virus icosaédrico pequeño y sin envoltura con un genoma lineal de ADN monocatenario de 4,7 kb. El AAV se descubrió por primera vez en la década de 1960 como un contaminante de las preparaciones de adenovirus5. A pesar de su pequeño tamaño de cápside, que limita el tamaño del transgén que se puede empaquetar a un máximo de 4,9 kb excluyendo los RTI6, el AAV es útil para la administración de transgenes porque no es patógeno en humanos, permite la expresión del transgén en muchos tipos de células que se dividen y no se dividen, y tiene efectos inmunogénicos limitados7.
Como miembros del género dependoparvovirus, la producción de rAAVs se basa en la expresión de genes auxiliares presentes en el adenovirus o virus del herpes simple8. Se han desarrollado varias estrategias para producir rAAV, pero la producción en células HEK293 transformadas con los genes auxiliares adenovirales E1A/E1B es el método más establecido y utilizado en la actualidad9. El enfoque general de la producción de rAAV comienza con la transfección de células HEK293 con tres plásmidos que contienen el transgén dentro de repeticiones terminales invertidas (ITR), genes AAV rep y cap , y genes auxiliares adenovirales adicionales, respectivamente. Setenta y dos horas después de la transfección, las células se cosechan y procesan para purificar el rAAV que contiene el transgén.
En el desarrollo de nuevos vectores rAAV con fines terapéuticos, uno de los principales objetivos es producir vectores con una mayor eficiencia de transducción. Un aumento en la eficiencia de transducción de las células diana significaría una disminución de la dosis clínica necesaria de rAAV, disminuyendo así la probabilidad de efectos inmunogénicos adversos que van desde la neutralización mediada por anticuerpos hasta toxicidades agudas10,11. Para mejorar la eficacia de la transducción de los vectores rAAV, se pueden realizar alteraciones en el genoma empaquetado o en la cápside. Los métodos viables para ajustar la eficacia de la transducción a través del diseño del genoma empaquetado incluyen la incorporación de promotores fuertes y específicos de tejido, la selección cuidadosa de los elementos de procesamiento del ARNm y la optimización de la secuencia de codificación para mejorar la eficiencia de la traducción12. Las alteraciones de la cápside se realizan con el objetivo de aumentar el tropismo para los tipos de células humanas diana. Los esfuerzos para desarrollar nuevas cápsidas de vectores de administración de transgenes rAAV generalmente se caracterizan por un enfoque en el diseño racional de cápsidas de AAV con mutaciones específicas dirigidas a receptores celulares específicos o la evolución dirigida para identificar cápsidas con tropismo para tipos celulares específicos a partir de bibliotecas de cápside combinatorias de alta complejidad sin dirigirse a un receptor específico (aunque algunos grupos combinan estos enfoques)13, 14,15. En el enfoque de evolución dirigida, las bibliotecas combinatorias de la cápside se construyen utilizando una columna vertebral de serotipo particular con regiones variables mutadas en el exterior de la cápside16. Las bibliotecas combinatorias de cápside a menudo se construyen a partir de serotipos de AAV que no se originan en humanos, lo que disminuye el riesgo de inmunidad preexistente durante el uso clínico10. Por lo tanto, los métodos de purificación que se pueden aplicar a cualquier serotipo son ideales para eliminar la necesidad de una optimización específica del serotipo para los serotipos menos utilizados que sirven como columna vertebral para estas bibliotecas.
La centrifugación en gradiente de densidad de yodixanol se utiliza para purificar altos títulos de rAAV con alta infectividad17. En este protocolo, el rAAV se produce en cultivo celular en suspensión para disminuir la cantidad de mano de obra necesaria para producir grandes títulos de AAV. También se incluye un paso de centrifugación para limpiar el lisado celular para reducir la presencia de proteínas contaminantes y disminuir el riesgo de precipitación de virus. Este protocolo es un método rentable para producir preparaciones de rAAV de alta pureza adecuadas para uso preclínico.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de purificación de doble gradiente de densidad de yodixanol es el método universal porque es aplicable a cualquier variante mutante de AAV, independientemente de su especificidad de receptor. Los primeros métodos de purificación de AAV se basaban en la densidad de partículas e incluían la centrifugación isopícnica en CsCl y la centrifugación continua en gradiente de densidad de sacarosa19. Posteriormente, se desarrollaron abordajes seroespecíficos que hicieron uso de anticue…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
| 8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
| Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
| Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
| Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
| Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
| CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
| Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
| Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
| Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
| Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
| Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
| Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
| Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
| Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
| Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
| JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
| Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
| Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
| Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
| Needle nose pliers | |||
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
| OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
| P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
| P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
| P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
| P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
| Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
| Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
| Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
| Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
| Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
| Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
| Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
| Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
| Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
| Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
| Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
| Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
| Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
| Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
| Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
| Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
| Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
| Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
| Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
| Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
| Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
| Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
| Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
| Water bath | Set at 37 °C |
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