Detectie en isolatie van Campylobacter spp. uit rauw vlees

Summary

Campylobacter is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van bacteriële gastro-enteritis door voedsel. Ondanks het feit dat bedrijven maatregelen nemen om de prevalentie in hun faciliteiten te verminderen, bereiken besmette producten consequent de consument. De techniek die in de afgelopen twaalf jaar is ontwikkeld, richt zich op de beperkingen van bestaande methoden voor het isoleren en detecteren van Campylobacter spp. uit rauw vlees.

Abstract

Dit artikel presenteert een snel maar robuust protocol voor het isoleren van Campylobacter spp. uit rauw vlees, specifiek gericht op Campylobacter jejuni en Campylobacter coli. Het protocol bouwt voort op gevestigde methoden en zorgt voor compatibiliteit met de gangbare technieken die worden gebruikt door regelgevende instanties zoals de Food and Drug Administration (FDA) en het Amerikaanse ministerie van landbouw (USDA) in de VS, evenals de International Organization for Standardization (ISO) in Europa. Centraal in dit protocol staat het verzamelen van een spoelmiddel, dat wordt geconcentreerd en geresuspendeerd in Bolton Broth-media die paardenbloed bevatten. Het is bewezen dat dit medium het herstel van gestreste Campylobacter-cellen vergemakkelijkt en de vereiste verrijkingsduur met 50% verkort. De verrijkte monsters worden vervolgens overgebracht op nitrocellulosemembranen op brucellaplaten. Om de gevoeligheid en specificiteit van de methode te verbeteren, werden filtermembranen met een poriegrootte van 0,45 μm en 0,65 μm geëvalueerd. Gegevens toonden een 29-voudige toename van celherstel met het poriegroottefilter van 0,65 μm in vergelijking met de poriegrootte van 0,45 μm zonder de specificiteit te beïnvloeden. De zeer beweeglijke eigenschappen van Campylobacter zorgen ervoor dat cellen actief door de membraanfilters naar het agarmedium kunnen bewegen, wat een effectieve isolatie van pure Campylobacter-kolonies mogelijk maakt. Het protocol omvat multiplex kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (mqPCR)-assay om de isolaten op soortniveau te identificeren. Deze moleculaire techniek biedt een betrouwbare en efficiënte manier om soorten te identificeren. Onderzoek dat de afgelopen twaalf jaar is uitgevoerd met vlees in de detailhandel, heeft aangetoond dat deze methode in staat is om het herstel van Campylobacter uit natuurlijk besmette vleesmonsters te verbeteren in vergelijking met de huidige referentiemethoden. Bovendien biedt dit protocol een kortere voorbereidings- en verwerkingstijd. Hierdoor is het een veelbelovend alternatief voor het efficiënt terugwinnen van Campylobacter uit vlees. Bovendien kan deze procedure naadloos worden geïntegreerd met op DNA gebaseerde methoden, waardoor een snelle screening van positieve monsters mogelijk wordt, naast een uitgebreide sequentieanalyse van het hele genoom.

Introduction

Campylobacter spp. zijn wereldwijd de belangrijkste oorzaak van bacteriële gastro-enteritis door voedsel, met naar schatting 800 miljoen gevallen per jaar¹. Als een belangrijke zoönotische bacterie koloniseert Campylobacter op natuurlijke wijze het maagdarmkanaal van een breed scala aan dieren, waaronder wilde vogels, boerderijdieren^{en huisdieren.} Tijdens het slachten of de verwerking van levensmiddelen besmetten Campylobacter spp. vaak karkassen of vleesproducten³. Campylobacteriose wordt meestal geassocieerd met de consumptie van onvoldoende verhit gevogelte of kruisbesmetting van ander voedsel door rauwe gevogeltesappen². Het kan ernstige complicaties veroorzaken, zoals het Guillain-Barré-syndroom, reactieve artritis en bloedvergiftiging bij immuungecompromitteerde^personen4. Het detecteren en isoleren van Campylobacter uit voedselbronnen, met name pluimveeproducten, is essentieel voor toezicht op de volksgezondheid, onderzoek naar uitbraken en risicobeoordeling.

Conventionele op kweek gebaseerde methoden zijn de traditionele en standaardmethoden voor Campylobacter-detectie ^5,6. Er zijn echter verschillende beperkingen, waaronder lange incubatietijden (48 uur of meer), lage gevoeligheid (tot 50%) en zijn niet inclusief voor alle stammen (sommige gestreste Campylobacter-cellen groeien mogelijk niet goed of helemaal niet in de media)⁷. Moleculaire methoden, zoals polymerasekettingreactie (PCR), zijn sneller en gevoeliger dan op cultuur gebaseerde methoden, maar ze bieden geen levensvatbare isolaten voor verdere karakterisering ^8,9.

Immunologische methoden zijn alternatieve en complementaire methoden voor de detectie van Campylobacter . Deze zijn snel, eenvoudig en veelzijdig, maar hebben ook verschillende beperkingen, waaronder kruisreactiviteit (sommige antilichamen kunnen binden aan niet-Campylobacter-bacteriën of andere stoffen die vergelijkbare antigenen delen), lage specificiteit (sommige antilichamen binden mogelijk niet aan alle Campylobacter-stammen of -serotypen) en vereisten voor monstervoorbereiding (immunologische methoden vereisen vaak voorbehandeling van de monsters om storende stoffen te verwijderen om de binding van de antilichamen te verbeteren)¹⁰.

Binnen het geslacht Campylobacter veroorzaken C. jejuni en C. coli de meeste Campylobacter-infecties bij de mens (respectievelijk 81% en 8,4%)¹¹. Beide zijn spiraalvormige, micro-aerofiele en thermofiele bacteriën die een unipolair flagellum of bipolaire flagella bevatten. Rotatie van een flagellum aan elke pool wordt beschouwd als zowel de primaire drijvende kracht voor de karakteristieke beweeglijkheid van de kurkentrekker als cruciaal voor de pathogenese omdat het de bacterie in staat stelt door het stroperige slijmvlies van het maagdarmkanaal van de gastheer te zwemmen. De beweeglijkheid van Campylobacter wordt gecontroleerd door het chemosensorische systeem dat de cellen in staat stelt om naar gunstige omgevingen te gaan^12,13. Op basis van de celmorfologie en fysiologische kenmerken van Campylobacter hebben enkele onderzoeken membraanfiltratie gebruikt voor de isolatie van Campylobacter spp. uit fecale en omgevingsmonsters 14,15,16.

Deze studie presenteert een snel en robuust protocol voor de isolatie en daaropvolgende detectie van C. jejuni en C. coli uit rauw vlees, dat de nadelen van de bestaande methoden overwint en verschillende voordelen biedt. Voorlopige kolonies kunnen worden bevestigd als Campylobacter spp. met behulp van verschillende methoden, zoals microscopie, biochemische tests (bijv. catalase- en oxidase-activiteitstests) of moleculaire methoden⁶. De methode identificeert de isolaten op soortniveau met behulp van een multiplex real-time PCR (mqPCR)-test die zich richt op genen die uniek zijn voor C. jejuni en C. coli. Deze methode is relatief goedkoop, snel en selectief, waardoor het geschikt is voor gebruik in verschillende omgevingen, waaronder voedselverwerkende faciliteiten, klinische laboratoria en onderzoekslaboratoria.

Protocol

Alle werkzaamheden in verband met dit protocol moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast (BSC) om aseptische omstandigheden te handhaven en het risico op monsterbesmetting of blootstelling van de operator aan microbiële pathogenen te minimaliseren. Gebruik bij het overbrengen van monsters buiten de BSC verzegelde containers om morsen te voorkomen in geval van onbedoeld vallen, waarbij de integriteit van het monster behouden blijft. Bij voorkeur moeten gedurende de hele procedure wegwerpcomponenten worden gebruikt om de mogelijkheid van kruisbesmetting te verkleinen. In gevallen waarin wegwerpartikelen niet haalbaar zijn, zorg er dan voor dat alle apparatuur en materialen steriel zijn voor gebruik. Goed afvalbeheer is cruciaal; Alle gebruikte wegwerpcomponenten moeten worden weggegooid als biologisch gevaarlijk afval. Autoclaaf materialen voordat ze worden weggegooid om een goede sterilisatie te garanderen en insluiting van potentieel gevaarlijke materialen te voorkomen. Het naleven van deze voorzorgsmaatregelen waarborgt niet alleen de integriteit van het monster, maar minimaliseert ook het risico van blootstelling van de operator aan microbiële pathogenen. Figuur 1 toont de workflow van monstervoorbereiding, selectieve verrijking, filtergebaseerde isolatie en mqPCR-differentiatie van Campylobacter-soorten . Aanvullend bestand 1 toont een meer gedetailleerde workflow en afbeeldingen gedurende het hele proces. 1. Bereiding van vleesmonsters Vleesmonsters verwervenKoop verschillende pakketten vers vlees, waaronder kippendijen, vleugels, drumsticks en levers van lokale retailers. Breng alle monsters over naar opslag bij 4 °C en verwerk ze binnen 24 uur na ontvangst.OPMERKING: Het bewaren van de verse monsters bij lagere temperaturen, zoals onder het vriespunt, heeft invloed op het herstel. Verwerken van vleesmonstersVolg de verhouding van componenten die is voorgeschreven in de FSIS-bemonsteringsrichtlijn 6,17. Snijd 450 g stukjes kip uit elke verpakking en doe ze in een stomacherzak (zie Materiaaltabel).OPMERKING: Stomacher-zakken worden aanbevolen omdat ze voldoende mechanische sterkte hebben om de stroomafwaartse processen te garanderen en niet scheuren of lekken. Bereid gebufferd peptonwater (BPW) voor.Los 20 g van het poeder (zie Materiaaltabel) op in 1 L gezuiverd water. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 15 min. Verdun de oplossing in steriel water tot een concentratie van 0,1%. Voeg 200 ml 0,1% BPW toe aan de stomacherzak met de kip. Masseer/palpeer het monster handmatig vanaf de buitenkant van de stomacherzak gedurende 2 minuten. Verzamel alle kippenspoeling van de gefilterde kant van de zak met behulp van een gemotoriseerde pipetcontroller (zie Materiaaltabel). Doseer de kipspoeling in steriele centrifugeflessen. Centrifugeer op 10.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vang het supernatans voorzichtig op met behulp van een gemotoriseerde pipetcontroller met een serologische plastic wegwerppipet van 25 ml. Voorkom dat u de pellet verstoort. Herhaal het proces indien nodig om ervoor te zorgen dat al het supernatans is verwijderd. Gooi het verzamelde supernatant weg. 2. Selectieve verrijking van Campylobacter uit rauw vlees Bereiding van Bolton-bouillon met supplementenLos 13,8 g poeder (zie materiaaltabel) op in 500 ml gezuiverd water. Steriliseer de bouillon in de autoclaaf gedurende 15 minuten bij 121 °C. Voeg 25 ml gelakt paardenbloed (zie Materiaaltabel) toe aan de gesteriliseerde Bolton-bouillon van 500 ml.OPMERKING: De toevoeging van paardenbloed werkt als een zuurstofblusmiddel om te helpen bij het herstel van gewonde Campylobacter-cellen uit de voedselmatrix. Reconstitueer 1 injectieflacon met een antibioticumsupplement (cefoperazon, cycloheximide, trimethoprim en vancomycine, zie materiaaltabel) in 5 ml 50% ethanol. Voeg het gereconstitueerde antibioticasupplement toe aan de Bolton-bouillon. VerrijkingsprocedureResuspendeer de pellet in 50 ml Bolton-bouillon met laked paardenbloed en antibiotica. Plaats monsters (met losgemaakte doppen) in een afgesloten container met een gasmengsel van 85%N2, 10% CO2 en 5%O2.Zorg ervoor dat de dop los zit, maar dat de container goed is afgesloten om de micro-aerofiele en thermofiele groeivereisten van Campylobacter te produceren.NOTITIE: Gaspakketten met een atmosfeer van 85%N2, 10% CO2 en 5%O2 kunnen worden gebruikt wanneer er geen klimaatkasten beschikbaar zijn. Incubeer de monsters gedurende 24 uur bij 42 °C. 3. Isolatie en zuivering van C. jejuni en C. coli uit rauwe kip Bereiding van Brucella agarplatenLos 28 g Brucella-poeder (zie materiaaltabel) op in 1 l gezuiverd water. Los 15 g agar op in de Brucella-oplossing. Steriliseer de Brucella-agar door deze gedurende 15 minuten in de autoclaaf bij 121 °C. Koel het medium-agarmengsel af in een waterbad van 55 °C. Giet 20 ml Brucella-agar in elke petrischaal met een diameter van 100 mm. Filtermethode en kolonieteeltEvalueer het effect van vocht op Campylobacter die door filters gaat door Brucella-agarplaten met geopende deksels gedurende 0 uur, 1 uur, 2 uur en 3 uur in een bioveiligheidskast te drogen. Bereid een niet-filterregeling voor door 80 μL van het monster rechtstreeks op de Brucella-agarplaat te verspreiden. Plaats een celluloseacetaatfilter (0,45 μm of 0,65 poriegrootte, zie Materiaaltabel) in het midden van een Brucella-agarplaat. Pipetteer 4 druppels/filter en 20 μL/druppel verrijkt monster op het filter.Plaats de druppels in de buurt van het midden van het filter om ervoor te zorgen dat de vloeistof die de plaat bereikt door het filter gaat, niet rond het filter. Plaats de druppels op een manier die ervoor zorgt dat ze zich niet verspreiden en ophopen. Incubeer druppels gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur en verwijder voorzichtig de filters.OPMERKING: Deze stap geeft de Campylobacter-cellen voldoende tijd om het membraan te passeren en het agarmedium te bereiken zonder overmatig drogen. Incubeer de platen bij 42 °C gedurende ongeveer 24 uur onder de eerder beschreven micro-aërobe omstandigheden. Kies karakteristieke Campylobacter-kolonies met specifieke eigenschappen.OPMERKING: Campylobacter-kolonies zijn meestal rond met gladde randen, glinsterend en doorschijnend geelachtig of roze van kleur6. Streep kolonies op Brucella-agarplaten voor zuivering. Herhaal deze stap totdat platen met een enkele uniforme koloniemorfologie zijn verkregen. Bereid monsters voor op langdurige opslag.Bereid Bolton Broth zoals eerder beschreven. Voeg een kolonie van de plaat toe met een uniforme koloniemorfologie. Kweek ‘s nachts (24 uur) onder eerder beschreven micro-aerofiele omstandigheden. Voeg 900 μL van de nachtcultuur toe aan een cryovial van 2 ml met 100 μL DMSO. Snel afkoelen in een droogijs-ethanolbad (ca. -72 °C) gedurende 10 min. Breng over naar een vriezer van -80 °C voor langdurige opslag. 4. Identificatie van C. jejuni- en C. coli-soorten Voer identificatie op soortniveau uit van C. jejuni en C. coli met behulp van een multiplex qPCR (mqPCR)-test die eerder is ontwikkeld18,19.Voer snelle cellyse en genomische DNA-extractie uit in een plaatformaat met 96 putjes.OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om het gebruik van commerciële kits te overwegen (zie Materiaaltabel) om ervoor te zorgen dat het monster voldoende vrij is van bekende PCR-remmers.Dispergeer gezuiverde Campylobacter-kolonies in 100 μL extractieoplossing. Lysemonsters bij 99 °C gedurende 10 minuten, gevolgd door afkoeling bij 20 °C gedurende 2 minuten in een thermocycler. Centrifugeer de plaat op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder 2 μL aliquots van het supernatans voor de mqPCR-test. Bereid een reactiemengsel van 20 μl bestaande uit 10 μl 2x Master Mix, 2,0 μl DNA-monster, 104 kopieën van het IAC-sjabloon (Internal Amplification Control) en 200 nM van elke primer en sonde (zie materiaaltabel).OPMERKING: De primers en sondes van hipO en cdtA zijn de exclusieve doelgenen voor respectievelijk C. jejuni en C. coli. De IAC bestaat uit een 79-bp DNA-segment van het humaan adenovirus en is opgenomen als een positieve controle om een consistente activiteit van DNA-polymerase in alle monsters te garanderen. Laad alle monsters in drievoud in een optische plaat met 96 putjes, bedekt met een optische film, en plaats ze in een Real-Time PCR-systeem (zie Tabel met materialen).Start een hot-start activering van het DNA-polymerase bij 95 °C gedurende 10 min. Volg met 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 15 s en gloeien/verlengen bij 60 °C gedurende 1 min. 5. Celsuspensies opsommen Celsuspensies opsommen met behulp van een 6 x 6 valplaatprocedure20. Raadpleeg Aanvullend bestand 1 voor afbeeldingen van de 6 x 6 valplaatmethode. Laat Brucella agarplaten met het deksel eraf gedurende 45 minuten aan de lucht drogen in een laminaire stroomkap. Voeg 200 μL bacteriële suspensie toe aan zes rijen (A-F) in de eerste kolom van een plaat met 96 putjes. Verdeel 180 μL Brucella medium over zes rijen van de overige kolommen (2-12). Bereid tienvoudige seriële verdunningen met behulp van 20 μL transfers.Breng bijvoorbeeld 20 μL monster over van kolom één naar kolom twee. Herhaal dit proces voor minimaal 6 kolommen. Reflux meng elke suspensie tien keer met behulp van de pipet, waarbij de punten tussen elke overdracht worden verwisseld. Gebruik een meerkanaalspipet om druppels van 7 μL uit zes rijen van een kolom op het oppervlak van een Brucella-agarplaat af te zetten. Herhaal dit om een matrix van 6 x 6 te maken, zodat rijen technische replica’s zijn voor verschillende kolommen. Laat de borden 5 minuten aan de lucht drogen en keer de plaat dan om. Incubeer de platen bij 42 °C gedurende 24 uur. Tel het aantal kolonies in elke representatieve verdunning.

Representative Results

Effect van vocht in Brucella agarplaten voor passieve filtratie van CampylobacterCampylobacter heeft een klein genoom en mist verschillende stressresponsgenen die vaak voorkomen in andere bacteriën, zoals E. coli O157:H7 en Salmonella. Daarom is het gevoeliger voor verschillende omgevingsstress en kan het geen uitdroging of zuurstofniveaus in de omgeving verdragen. Omgekeerd kan een te vochtig agarmedium het filter overspoelen. Dit veroorzaakt niet alleen diffusie van het monster naar buiten het filter, maar verhoogt ook de blootstellingstijd aan zuurstof21. Om de juiste omstandigheden te bepalen voor filtergebaseerde isolatie van Campylobacter, werden Brucella-agarplaten gedroogd met de deksels verwijderd gedurende 0 uur, 1 uur, 2 uur en 3 uur in een biologische veiligheidskast en beoordeeld op de efficiëntie van Campylobacter-cellen om een filter met een poriegrootte van 0,65 μm te passeren. Vier aliquots van 20 μl C. jejuni S27-culturen in concentraties van 1,53 x 104 en 1,53 x 105 kve/ml werden gepipetteerd op elk filtermembraan dat op een Brucella-plaat was geplaatst. Na 15 minuten penetratie werden filters verwijderd en werden platen ‘s nachts geïncubeerd voor celgroei. Cellen van 5 gerepliceerde platen werden vervolgens geteld en genoteerd in tabel 1. De resultaten gaven aan dat de agarplaten die gedurende 2 uur en 3 uur waren gedroogd, op dezelfde manier presteerden met bijna gelijke aantallen cellen die waren teruggevonden bij passieve filtratie. Het is opmerkelijk dat de platen die onder deze omstandigheden gedurende 0 uur en 1 uur werden gedroogd, de cellen niet in staat stelden het membraan volledig te passeren binnen de gebruikte tijdsperiode van 15 minuten. Vergelijking van filtermembranen van verschillende poriegroottes voor het isoleren van Campylobacter uit kippenleversRekening houdend met de Campylobacter-celgroottes (0,5-5 μm lang en 0,2-0,9 μm breed) en een breed scala aan voedseldeeltjesgroottes, werden celluloseacetaatfilters met poriegroottes van 0,45 μm en 0,65 μm getest op de efficiëntie van Campylobacter-passage bij een incubatietijd van 15 minuten. Voor het experiment werden voedselmonsters gebruikt die bestonden uit 450 g kippenlevers verrijkt met 153 CFU C. jejuni en vervolgens ‘s nachts verrijkt. Als controle zonder filter werd de directe beplating van het verrijkingsmonster parallel opgenomen. De resultaten (Figuur 2) van 5 gerepliceerde platen toonden consequent aan dat het filter met een poriegrootte van 0,65 μm meer cellen doorliet dan de filters met een poriegrootte van 0,45 μm, wat resulteerde in een toename van ~29 keer meer verkregen cellen. Het poriegroottefilter van 0,45 μm behield te veel cellen aan de bovenzijde van het filter, wat resulteerde in een aanzienlijk lagere terugwinning van Campylobacter uit voedsel in vergelijking met het poriegroottefilter van 0,65 μm. Zoals verwacht groeide er een gazon met verschillende achtergrondorganismen op de controleplaten zonder filter. Toepassing van passieve filtratie in Campylobacter-isolatie uit retailkipVanwege de ongewone beweeglijkheid van Campylobacter-cellen werd de passieve filtratietechniek geselecteerd voor de isolatie van C. jejuni en C. coli uit vleesproducten in de detailhandel, die doorgaans besmet zijn met tal van achtergrondorganismen. Tussen de jaren 2014-2023 werden in totaal 79 rauw vleespakketten, waaronder verschillende delen kippenvlees, kippenlevers, runderlevers en kalfslevers, opgehaald bij verschillende lokale supermarkten. Van elke verpakking werd 450 g bemonsterd voor de isolatie van Campylobacter spp. Door selectieve verrijking van Campylobacter in bloedbevattende Bolton-bouillon te combineren met passieve filtratie van de cellen door een celluloseacetaatfilter met een poriegrootte van 0,65 μm rechtstreeks op een Brucella-agarplaat, zijn 49 Campylobacter-stammen met succes geïsoleerd uit 79 vleesmonsters (tabel 2). Figuur 3 geeft het resultaat weer van het isoleren van een nieuwe Campylobacter-stam uit kippenlevers. De methode is herhaaldelijk bewezen gevoelig, specifiek en kosteneffectief te zijn. Identificatie en differentiatie van C. jejuni- en C. coli-isolatenOm het geslacht te verifiëren en de soorten Campylobacter-isolaten verkregen uit rauw vlees te differentiëren, werd een multiplex qPCR-test gebruikt die de specifieke gendoelen (hipO en cdtA) voor C. jejuni en C. coli amplificeert, en een interne amplificatiecontrole (IAC). De IAC werd opgenomen als een vals-negatieve indicator in de gelijktijdige amplificatie van meerdere genen. De test werd uitgevoerd in een formaat met 96 putjes met snelle cellyse en DNA-extractie met behulp van een in de handel verkrijgbaar reagens (zie materiaaltabel). Tabel 2 geeft een overzicht van het resultaat van de soortidentificatie van de C. jejuni – en C. coli-stammen . Als extra verificatie bevestigden de resultaten van de sequentiebepaling van het hele genoom de soort van alle isolaten (gegevens niet getoond). Figuur 1: Een werkstroomdiagram voor de isolatie en identificatie van Campylobacter-soorten uit vlees in de detailhandel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: De impact van filtergrootte op het herstel van Campylobacter. De resultaten geven aan dat het 0,65 μm-filter gemiddeld 900 ± 138 kolonies kan herstellen, terwijl het 0,45 μm-filter 31 ± 7 kolonies kan herstellen. De resultaten werden gegenereerd uit N = 20 (5 platen met 4 druppels/plaat) en de t-toets van een student geeft aan dat de gemiddelden statistisch verschillend zijn (p < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Isolatie van Campylobacter door passieve filtratie van verrijkte pluimveemonsters. (A) Toont de vier druppels verrijkt monster van 20 μl die op het nitrocellulosemembraanfilter zijn afgezet. Het beeld werd verzameld tijdens de 15 minuten passieve filtratie. (B) Toont de plaat nadat het nitrocellulosefilter is verwijderd. De vier vlekken geven aan waar het verrijkte monster het membraan is doorkruist. (C) Toont de plaat na 24 uur incubatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Tabel 1: Het effect van de droogtijd van Brucella agarplaten op de passieve filtratie van C. jejuni. Klik hier om deze tabel te downloaden. Tabel 2: C. jejuni- en C. coli-stammengeïsoleerd uit rauw vlees. In de periode van 2008 tot 2023 werden 36 C. jejuni – en 13 C. coli-stammen geïsoleerd uit 79 vleesverpakkingen in 24 unieke retailproducten. Klik hier om deze tabel te downloaden. Aanvullend bestand 1: Afbeeldingen tijdens de isolatie- en inventarisatieprocessen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Betekenis van het protocol
C. jejuni en C. coli waren de twee belangrijkste soorten Campylobacter die veel voorkwamen bij pluimvee²² en dierlijke levers^23,24. In deze studie werden de vleesmonsters van kippendelen (poten, vleugels en dijen), kippenlevers en runderlevers willekeurig verzameld gedurende verschillende tijdsperioden en van verschillende winkels en fabrikanten voor de isolatie van Campylobacter spp. Van de in totaal 49 geïsoleerde Campylobacter-stammen werden er 36 geïdentificeerd als C. jejuni en 13 als C. coli, zonder dat er andere Campylobacter-soorten werden gevonden, wat consistent is met andere rapporten²⁵.

De test is gebaseerd op de spiraalvormige celmorfologie en karakteristieke kurkentrekkerachtige beweeglijkheid van Campylobacter spp. Een eenvoudige, maar effectieve, passieve filtratietechniek^26,27 die gebruik maakte van zijn spiraalvormige celmorfologie (lang, slank, 0,2-0,9 bij 0,5-5 μm) en sterke beweeglijkheid van de kurkentrekker werd gebruikt om Campylobacter te scheiden van een mengsel van achtergrondorganismen. De hoge beweeglijkheid van Campylobacter stelde de cellen in staat om de membraanfilters te passeren en naar gunstige omstandigheden in het agarmedium te gaan, terwijl andere achtergrondmicro-organismen van de vleesproducten er niet doorheen konden. Deze methode is relatief goedkoop, snel en selectief, waardoor het geschikt is voor gebruik in verschillende omgevingen, waaronder voedselverwerkende faciliteiten, klinische laboratoria en onderzoekslaboratoria.

Een baanbrekend artikel dat vaak wordt geciteerd, stelt dat het 0,45 μm-filter zo goed werkte dat 0,65 μm niet werd geëvalueerd²⁸. De resultaten van deze huidige studie geven aan dat het filter met een poriegrootte van 0,65 μm significant beter presteerde dan het poriefilter van 0,45 μm, wat resulteerde in een 29-voudige toename van het aantal cellen dat uit de verrijking werd teruggewonnen. Dit is belangrijk omdat de geselecteerde filters geen verminderde selectiviteit vertonen, zoals eerder gemeld²⁹. Verder, aangezien bekend is dat filteren de hoeveelheid teruggewonnen Campylobacter aanzienlijk zal verminderen in vergelijking met directe beplating³⁰, verbetert het vergroten van de porie het herstel van het micro-organisme, wat consistent is met eerder gerapporteerde bevindingen²¹. Dit is belangrijk omdat alle cellen die de filters doorkruisten uniforme Campylobacter-kolonies vormden, wat aangeeft dat beide filters voldoende waren om te voorkomen dat andere microflora en voedseldeeltjes er doorheen gingen. Bovendien wijst het FSIS-stroomdiagram⁷ op het potentieel voor een langere resultaatproductie als gevolg van het opnieuw strepen van isolaten op Campy-Cefex-platen die antibiotica bevatten. Daarentegen heeft het protocol dat in dit manuscript wordt beschreven, dat het gebruik van filtratie en selectieve verrijking combineert met cefoperazon, cycloheximide, trimethoprim en vancomycine, het niet nodig gemaakt om opnieuw te strepen.

De huidige methode die wordt gebruikt, is in overeenstemming met de huidige FSIS-bemonsterings- en verificatieprogramma’s¹⁷. Aangezien de besmettingsgraad met Campylobacter laag kan zijn (153 kve/450 g kip), wordt de spoeling gecentrifugeerd om het monster met een factor vier te concentreren, wat de gevoeligheid van de test verhoogt. Na concentratie van het spoelen met een factor 4x, worden monsters gedurende 48 uur verrijkt en gescreend met het Molecular Detection System (MDS) om de methode te repliceren die wordt gebruikt door FSIS-laboratoria (gegevens niet getoond). Met name de beschreven methode is er nog niet in geslaagd om binnen 24 uur positieve stammen te identificeren die werden gedetecteerd door het moleculaire detectiesysteem met behulp van 48 uur verrijking (gegevens niet getoond). Ten slotte is een bijkomend voordeel van dit protocol dat het informatie kan geven met betrekking tot de bacteriesoort en kan identificeren of de Campylobacter C.coli, C. jejuni of C. lari is, terwijl de MDS die in MLG 41.07 is aangenomen, alleen een binaire positieve/negatieve respons voor Campylobacter kan geven.

Kritische stappen
Het protocol voor Campylobacter-isolatie en -identificatie vereist precisie tijdens centrifugatie, filtratie en moleculaire analyse. Nauwkeurige verdunningen, de juiste incubatieomstandigheden en nauwgezette naleving van de qPCR-testvoorwaarden zijn cruciaal voor een betrouwbare identificatie van soorten.

Als micro-aerofiele bacterie is Campylobacter zeer kwetsbaar en gevoelig voor verschillende omgevingsstress en vereist het unieke kieskeurige omstandigheden voor groei 31,32,33. In voedselmonsters die doorgaans lange perioden van transport en opslag ondergaan, bevinden veel Campylobacter-cellen zich misschien in een rusttoestand of subletale/dodelijke gewonde toestand^34,35. Het is dus belangrijk om de gestreste cellen uit hun voedselmatrices te halen en ze tot een hogere concentratie te laten groeien. In de eerste stap van de procedure gebruikten we Bolton-bouillon aangevuld met paardenbloed en antibiotica voor selectieve verrijking van Campylobacter uit voedsel. Het add-in bloed diende als zuurstofblusmiddel om de nadelige effecten van vrije zuurstofradicalen te overwinnen³⁶. De antibiotica werden gebruikt om de groei van achtergrondmicroflora te remmen³⁷.

Om de blootstellingstijd van Campylobacter aan atmosferische zuurstof te minimaliseren, werd een incubatietijd van 15 minuten geselecteerd om de cellen in staat te stellen het filter te passeren. Ook het vocht van de Brucella agarplaat onder het filter speelde een belangrijke rol in de doorgangssnelheid. In het bijzonder suggereerden de resultaten van het testen van agarplaten die gedurende 0 uur, 1 uur, 2 uur en 3 uur waren gedroogd, dat een hoog vochtgehalte in het filter verhinderde dat cellen erdoorheen gingen. Even belangrijk is de precieze plaatsing van filters en druppels op de platen en filters, die beide het succes van het isoleren van cellen beïnvloeden.

Mogelijke valkuilen en beperkingen
Hoewel het een gestructureerde aanpak presenteert voor het isoleren en identificeren van Campylobacter-soorten uit rauwe kippenmonsters, verdienen verschillende beperkingen van dit protocol aandacht. Uitwendige verontreiniging, onvoldoende gedroogde platen, verstopping van filters die microbiële beweging belemmeren, insluiting van de micro-organismen in de pellet, onvolledige afdichting van de atmosferische kamer en druppels die zich buiten de filtergrenzen verspreiden, behoren tot de belangrijkste valkuilen.

Een ontoereikende scheiding van de micro-organismen van de voedseloppervlakken of hun opsluiting in het grootste deel van het monster kan de isolatie ervan met deze methode belemmeren. Bovendien vormt het vertrouwen op microbiële beweeglijkheid voor het doorkruisen van passieve filters een opmerkelijke beperking; het is mogelijk dat de filtermembranen enkele minder beweeglijke Campylobacter-stammen hebben behouden, omdat is aangetoond dat filters de vangefficiëntie van microbiële pathogenen in voedsel kunnen verminderen³⁸. Verdere beperkingen zijn onder meer het batchkarakter van centrifugatie- en filtratieprocessen, de gevoeligheid voor verstopping van het filter en de inefficiëntie bij het dispergeren van de gevormde pellet, wat van invloed zal zijn op de nauwkeurigheid van microbiële belastingen. Deze beperkingen benadrukken gezamenlijk de noodzaak van voorzichtigheid en aanvullende methodologieën bij het waarborgen van uitgebreide analyse, vooral wanneer het gaat om verschillende soorten steekproeven of het zoeken naar mogelijkheden met een hoge doorvoer.

Suggesties voor het oplossen van problemen
Om mogelijke problemen te voorkomen, moet u er in eerste instantie voor zorgen dat alle materialen voldoen aan de noodzakelijke kwaliteitsnormen en niet zijn verlopen. Los problemen met verstopte filters op door mogelijk een extra filtratie toe te passen om grote verontreinigingen te verwijderen die de doorgang van de Campylobacter door het nitrocellulosemembraan kunnen beperken. Als verontreiniging wordt waargenomen, controleer dan of de druppels niet te dicht bij de rand van het filter zijn geplaatst en dat vloeistof de agar heeft kunnen bereiken door rond het filter te gaan in plaats van door de poriën. Als er na verrijking onvoldoende groei is, controleer dan of de afdichtingen van de atmosferische containers goed vastzitten en niet lekken.

Potentiële verfijning en uitbreiding
Het onderzoeken van alternatieve filtermaterialen kan de microbiële verplaatsing verbeteren en het mogelijk maken dit protocol uit te breiden voor gebruik bij het isoleren van andere beweeglijke micro-organismen uit heterogene mengsels zoals voedsel. Het is raadzaam om controles te identificeren om minder beweeglijke Campylobacter-varianten te behouden zonder de specificiteit negatief te beïnvloeden. Bovendien, hoewel is aangetoond dat de gemultiplexte qPCR-test die in deze studie wordt gebruikt, de mogelijkheden heeft om C.lari te detecteren, kunnen¹⁸ andere Campylobacter-soorten van belang in deze test worden opgenomen.

Samenvattend konden we stellen dat door verschillende parameters en instellingen te evalueren, de juiste omstandigheden werden gecreëerd voor isolatie op basis van filters en identificatie op soortniveau van C. jejuni en C. coli uit voedsel. Het is aangetoond dat de methode gevoelig, specifiek, robuust en kosteneffectief is. Door het toe te passen op echte voedselmonsters, was het protocol in staat om 36 C. jejuni – en 13 C. coli-stammen te isoleren uit 79 vleespakketten.

Het protocol is afgestemd op FSIS-richtlijn 10,250.1¹⁷, die de procedure schetst voor het bemonsteren van rauwe kipdelen, en MLG 41.07⁶ voor isolatie en identificatie van Campylobacter. De gegevens suggereren dat het concentreren van het monster met 4x en het verrijken gedurende 24 uur, in combinatie met filtratie en plating, geïsoleerde, bevestigde kolonies oplevert binnen 48 uur in plaats van 96 uur. Het protocol is compatibel met op DNA gebaseerde methoden zoals genoomsequencing om een uitgebreide karakterisering van Campylobacter-stammen te bieden, inclusief hun antimicrobiële resistentieprofielen, virulentievoorspellingen en fylogenetische relaties. Het protocol is een veelbelovend alternatief voor de efficiënte terugwinning en isolatie van Campylobacter spp. uit rauw pluimvee, wat epidemiologische studies en interventies op het gebied van de volksgezondheid kan vergemakkelijken.

Materials

Agar – Solidifying Agent (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	281230
Analytical Balance	Mettler Toledo	JL602-G/L	Equipment
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S	Equipment
Antibiotic supplements cefoperazone, cycloheximide, trimethoprim, vancomycin	Oxoid Ltd.	SR0183E
Atmosphere Control Gas Pak  (Campy, 85% N2, 10% CO2, and 5% O2)	Becton, Dickinson and Company (BD)	260680
Atmosphere Control Vessel,  GasPak EZ CampyPak container system	Becton, Dickinson and Company (BD)	260678
Autoclave – Amsco Lab250, Laboratory Steam Sterilizer	Steris plc	LV-250	Equipment
Biological Safety Cabinet, Type A2, Purifier Logic+	Labconco Corporation	302411101	Equipment
Bolton broth	Oxoid Ltd.	CM0983
Brucella broth (Difco)	Becton, Dickinson and Company (BD)	211088
Buffered Peptone Water	Bio-Rad Laboratories Inc.	3564684
Centrifuge Microcentrifuge 5424	Eppendorf	5424	Equipment
Centrifuge, Avanti J-25	Beckman Coulter, Inc.		Equipment
Chicken thighs, wings, drumsticks, livers	Local retailers
DNA Extraction – PreMan Ultra Sample Preparation Reagent	Thermo Fisher Scientific Inc.	4318930
FAM probe for hipO (Sequence 5'-TTGCAACCTCACTAGCAAAATCC ACAGCT-3')	Integrated DNA Technologies
Filter – 0.45 µm sterile cellulose acetate filter	Merck-Millipore LTD	DAWP04700
Filter – 0.65 µm sterile cellulose acetate filter	Merck-Millipore LTD	HAWG04700
forward primer for cdtA (Sequence 5'-TGTCAAACAAAAAACACCAAGCT T-3' ')	Integrated DNA Technologies
forward primer for hipO (Sequence 5'-TCCAAAATCCTCACTTGCCATT-3')	Integrated DNA Technologies
forward primer for IAC (Sequence 5'-GGCGCGCCTAACACATCT-3')	Integrated DNA Technologies
HEX probe for cdtA (Sequence 5'-AAAATTTCCCGCCATACCACTTG TCCC-3')	Integrated DNA Technologies
Incubator – Inova 4230 refrigerated incubator shaker	New Brunswick Scientific	4230	Equipment
Inoculating Loop – Combi Loop  10µL and 1µL	Fisher Scientific International, Inc	22-363-602
Internal Amplification Control (IAC) DNA fragment (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTAT GTGGTGGCATTGTCTTCTCCC GTTGTAACTATCCACTGAGATG TGTTAGGCGCGCC-3')	Integrated DNA Technologies
Laked horse blood	Remel Inc.	R54072
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+	Mettler Toledo	17014382	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-100XLS+	Mettler Toledo	17014384	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-10XLS+	Mettler Toledo	17014388	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+	Mettler Toledo	17014391	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+	Mettler Toledo	17014392	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-200XLS+	Mettler Toledo	17013805	Equipment
Manual pipette Pipet-Lite Multi Pipette L8-20XLS+	Mettler Toledo	17013803	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 1 L Square Glass  Bottle, with GL45 Screw Cap	Corning Inc.	1396-1L	Equipment
Media Storage Bottle -PYREX 2 L Round Wide Mouth Bottle, with GLS80 Screw Cap	Corning Inc.	1397-2L	Equipment
Microtiter plate, 96 well plate, flat bottom, polystyrene, 0.34 cm2, sterile, 108/cs	MilliporeSigma	Z707902
Mixer – Vortex Genie 2	Scientific Industries Inc.	SI-0236	Equipment
Motorized pipette controller, PIPETBOY2	INTEGRA Biosciences Corp.		Equipment
PCR Mastermix 2× TaqMan Gene Expression	Thermo Fisher Scientific Inc.	4369542
Petri Dish Rotator -  bioWORLD Inoculation Turntable	Fisher Scientific International, Inc	3489E20	Equipment
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15mm)	Fisher Scientific International, Inc	FB0875713
Pipette Tips GP LTS 1000µL S 768A/8	Mettler Toledo	30389273
Pipette Tips GP LTS 20µL 960A/10	Mettler Toledo	30389270
Pipette Tips GP LTS 200µL F 960A/10	Mettler Toledo	30389276
Reagent Reservoir, 25 mL sterile reservoir used with multichannel pipettors	Thermo Fisher Scientific Inc.	8093-11
Realtime PCR – 7500 Real-Time PCR system	(Applied Biosystems, Foster City, CA)		Equipment
reverse primer for cdtA (Sequence 5'-CCTTTGACGGCATTATCTCCTT-3')	Integrated DNA Technologies
reverse primer for hipO (Sequence 5'-TGCACCAGTGACTATGAATAACG A-3')	Integrated DNA Technologies
reverse primer for IAC (Sequence 5'-TGGAAGCAATGCCAAATGTGTA -3')	Integrated DNA Technologies
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (10 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170356N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (2 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170372N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (25 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170357N
Serological Pipettes, Nunc Serological Pipettes (50 mL)	Thermo Fisher Scientific Inc.	170376N
Spreader – Fisherbrand L-Shaped Cell Spreaders	Fisher Scientific International, Inc	14-665-230
Stomacher bag, Nasco Whirl-Pak Write-On Homogenizer Blender Filter Bags	Thermo Fisher Scientific Inc.	01-812
TAMRA probe for IAC (Sequence 5'-TTACAACGGGAGAAGACAATGCC ACCA-3')	Integrated DNA Technologies
Thermocycler (GeneAmp PCR system 9700)	Applied Biosystems		Equipment
Water Filtration – Elga Veolia Purelab Flex	Elga LabWater	PF2XXXXM1-US	Equipment